Summary
В этом видео мы продемонстрирована высокая эффективность электромуфтовой клеток
Abstract
Сотовые электромуфтовой является безопасным, невирусных и нехимических методов, которые могут быть использованы для получения гибридных клеток для терапии человека. Электромуфтовая предполагает применение коротких высоковольтных электрических импульсов к клеткам, которые находятся в тесном контакте. Применение Короче говоря, высоковольтных импульсов электрических причин дестабилизации клеточных мембран плазмы. Дестабилизировали мембраны более проницаемыми для различных молекул, а также склонных к слиянию с любыми соседними дестабилизировали мембран. Электромуфтовая, таким образом, удобный способ для достижения неспецифические слияние очень разные клетки
Protocol
I. Загрузка клеток с сотового трекеры CMFDA и CMRA
- Эксперименты проводились на заранее подготовленные клетки меланомы мыши клеточной линии (B16-F1). Клетки, выращенные в двух отдельных 25 см 2 колбах культуры (ТЭС, ZDA) до 70-80% слияния в культуральной среде DMEM (среда Дульбекко изменение Орла) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,15 мг / мл L-глутамина, 16 мг / мл гентамицина (все от Sigma-Aldrich, Германия), 200 ед / мл crystacillin (Плива, Хорватия), и инкубировали в 5% CO 2 при температуре 37 ° C.
- Приготовьте два 10 мМ растворы клеточных трекеры (Invitrogen, США), добавляя 10,76 мкл и 9 мкл (для зеленого CMFDA и оранжевой CMRA, соответственно) ДМСО (Sigma-Aldrich, Германия) до 50 мкг красителя в исходном Invitrogen флаконе. Маточный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Перед началом экспериментов, разогреть решение пока кристаллы ДМСО растворяются.
- Подготовка бикарбоната без Кребса Hepes буфера (130 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 11,7 мМ D-глюкозы, 1,3 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,4). В двух 15 мл Eppendorf труб отдельно смеси 2,1 мкл каждого стандартного раствора (10 мМ CMFDA или CMRA, соответственно) в 3 мл бикарбоната без Кребса Hepes буфера. Это дает "загрузки решение", содержащий около 7 мкМ CMFDA (или CMRA).
- Промойте клетки в два раза с бикарбонатом без Кребса Hepes буфер, а затем вставить загрузку решений в колбах. Инкубируйте клетки в течение 30 минут в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Во время этой первой инкубации реагентов свободно проходить через клеточные мембраны, но как только внутри клетки, реагенты превращаются в клеточной impermeant флуоресцентных продуктов реакции.
- После первой инкубации, промыть и инкубировать клетки с питательной среде в течение еще двух часов в 5% CO 2 при температуре 37 ° C.
- Trypsinize клетки в обоих колбах (загружается с CMFDA и CMRA) и смешать красный и зеленый клетки вместе в соотношении 1:1 в 50 мл центрифужную пробирку (ТЭС, ZDA). Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 х 10 6 клеток / мл путем разбавления среды DMEM или концентрации с центрифугой. Место 20 мкл каплю суспензии клеток в каждой лунке от 24 многоямного пластины (ТЭС, ZDA). Инкубируйте клеток в 5% CO 2 при 37 ° С в течение 20 минут, чтобы позволить им немного приложить к поверхности хорошо и установить контакты клетка.
II. Электромуфтовая
- Подготовка isoosomolar фосфатного буфера калия (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K 2 HPO 4, 1 мМ MgCl 2, 250 мМ сахарозы) и hypoosmolar калий фосфатного буфера (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K 2 HPO 4, 1 мМ MgCl 2, 75 мМ сахарозы) .
- Место многоямного с ячейками на столике микроскопа, положение электродов на дно колодца и соединить их с генератора импульсов.
- Вымойте клеток с 1 мл isoosomolar калий фосфатного буфера. Добавить 350 мкл hypoosmolar калий фосфатного буфера, чтобы вызвать отек ячейки. Буфер должен покрывать электроды.
- Оставьте клеток в hypoosmolar буфера в течение 2 минут перед нанесением электрических импульсов. За это время приток молекул воды в клетки из-за осмотического дисбаланса между внутренней и внешней стороне клетки причиной увеличения объема клеток. Электрические импульсы должны применяться, когда клетки близки к максимальным объемам, прежде чем начать нормативно уменьшения громкости.
- Для достижения оптимального электромуфтовой и поддерживать жизнеспособность клеток, оптимальных параметров электрических импульсов должен быть использован. Они зависят от клеточной линии использовались [1]. В этом эксперименте поезд из 8 прямоугольных импульсов (каждый продолжительностью 100 мкс с частотой 1 Гц) применяется к каждому образцу, используя электропорации устройства (в нашем случае Cliniporator, IGEA, Италия). Импульсы поступают в двух параллельных Pt / Ir электродов проволоки с диаметром 0,8 мм и 5 мм расстояние между ними, создавая электрическое поле около 1200 В / см между электродами в каждой лунке, за исключением контрольный колодец.
- Оставьте клетки в покое на 10 минут после импульса доставки. Определить слияние выход с помощью флуоресцентной и фазового контраста микроскопии.
III. Приобретение изображения и определение слияния выход
- Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Германия), оснащенных цели (x20) и охлаждением ПЗС-камеры (VisiCam 1280, Visitron, Германия). Изображения, приобретенные в Метаморф 7.1.1 (Molecular Devices, США), но и других подобных программ приобретения также могут быть использованы. CMFDA волнует монохроматора (полихромные IV, Visitron, Германия) при 492 нм и CMRA на 548 нм. Флуоресценции CMFDA и CMRA приобретается с помощью двух выбросов фильтрами, один с центром в нм 535 (HQ535/30m, для CMFDA), а другая с центром в точке 510 нм (D605/55m, для СMRA, как Chroma, США). Использование дихроичных зеркала (Q515LP) помешали говорить канал крест.
- Приобретать три изображения (фазового контраста, красного и зеленого свечения) в течение пяти случайно выбранных полей в каждую лунку. Создать три изображения канала от каждого изображения триплет. В таких изображений флуоресцирующих цитоплазму можно увидеть вместе с клеточных мембран. Плавленый клетки Таким образом, можно легко определить [Рисунок 1].
- Подсчет всех трех типов клеток (красный, зеленый и двойственно флуоресцентные) в каждом три канала изображения. Определить процент дуально флуоресцентные клетки путем деления числа дуально флуоресцентных клеток с числом всех клеток в каждом изображении. Fusion доходность определяется как процент дуально флуоресцентные клетки умножаются на 2, так как половина плавленого клеток не обнаружено (когда клетки одного и того же предохранитель цвета).
Представитель Результаты
Рисунок 1 Три канала микроскопии образ B16F1 клеток после электромуфтовой. Фазового контраста, CMRA флуоресценции (возбуждение при 548 нм) и CMFDA флуоресценции (возбуждение при 492 нм), цель увеличение 20x
Discussion
Способность клеточных мембран к предохранитель неспецифически, например, с помощью внешнего электрического поля, имеет большое значение для биотехнологий, медицины и научных исследований в биологии. Такие неспецифические слияние позволяет получать весьма ценные гибридные клетки и их продукты, такие как моноклональные антитела, и предоставляет информацию о фундаментальных механизмов синтеза [2]. Электромуфтовая является потенциально очень эффективный метод, так как это может быть правильно отрегулирован для различных типов клеток. Электромуфтовая достигается тогда, когда клетки в тесном физическом контакте были приведены в их fusogenic состоянии (склонные к слиянию) с помощью высоковольтных электрических импульсов. Эффективность электромуфтовой зависит от различных параметров, которые влияют на две части электромуфтовой процесса. Первая часть электромуфтовой процесса является достижение близкий физический контакт между клетками, которые могут быть получены различными методами [3-8]. Соблюдение метод (растущих клеток до слияния) могут быть эффективно использованы из-за спонтанно создана ячейка контактов в крупных зонах между клетками, однако, он производит очень большое плавленого клетки с многочисленными ядрами. Мы с помощью модифицированного метода приверженности, где мелкие клетки (с 2 до 5 ядер), которые имеют больше шансов выжить и размножаться, получены (рис. 1). Контакт между клетками также извлечь выгоду из осмотическое набухание клеток, из-за осмотического лечение, используемое в эксперименте [9]. Вторая часть электромуфтовой процесс достижения fusogenic состояние клеточных мембран. Fusogenic состоянии хорошо коррелирует с electropermeabilized состояние мембраны (клетки неспецифически проницаемыми для молекул, которые обычно не могут пройти через неповрежденную мембрану) и управляется одними и теми же параметрами электрических импульсов (амплитуда, длина, количество и частота) [10] . Значения электрических параметров, необходимых для оптимального электропорации [1] и электромуфтовой отличаются между различными клетками и зависят от размера ячеек и их биологические свойства. Электрические параметры таким образом, должны быть оптимизированы для различных клеточных линий, которые используются как слияние партнеров, для получения синтез.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана словенского агентства исследований (проект J2-9764 и программу Р2-0249). Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуру, организованный факультет электротехники в университете Любляны, Словения.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
| CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
| Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| KH2PO4 | Reagent | Merck & Co., Inc. | A124873 927 | |
| KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
| KCl | Reagent | Merck & Co., Inc. | A154336 908 | |
| MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| Electric pulse generator | Tool | IGEA | Cliniporator VITAE | |
| Multiwell plate | Tool | Techno Plastic Products | 92424 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tool | Techno Plastic Products | 91050 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 25 cm2 culture flask | Tool | Techno Plastic Products | 90026 | |
| Electrodes | Tool | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).
- Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).
- Rols, M. -P., Teissié, J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure. Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).
- Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. Methods in Enzymology. 220, 174-196 Forthcoming.
- Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions. Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).
- Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R.
- Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. Cell hybridization by electrofusion on filters. Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).
- Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip. Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).
- Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization. Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).
- Teissié, J., Ramos, C. Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes. Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).
