Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Summary

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon göstermektedir<em> In vitro</em> Elektroporasyon ve floresan mikroskobu ile erimiş hücreler görselleştirme sonraki algılama kullanarak modifiye bağlılık yöntem sayesinde.

Abstract

Hücre elektrofüzyon hibrit hücrelerinin, insan tedavisi için hazırlamak için kullanılan güvenli bir non-viral ve kimyasal olmayan bir yöntemdir. Elektrofüzyon yakın temas içinde olan hücrelere kısa yüksek voltajlı elektrik darbeleri uygulama içerir. Kısa, yüksek voltajlı elektrik darbeleri Uygulama hücre plazma membranlar istikrarsızlaştırma neden olur. Istikrarsızlaştırdı membranlar farklı moleküller için daha geçirgen ve aynı zamanda herhangi bir komşu istikrarsızlaştırdı membranlar ile füzyonu eğilimli. Elektrofüzyon böylece çok farklı hücreler non-spesifik bir füzyon sağlamak için uygun bir yöntemdir<em> In vitro</em>. Elektrik alanı istikrarsızlaştırdı füzyon, hücre zarları, elde etmek için, kendi çift katlı lipit katmanını birleştirme ve dolayısıyla sitoplazma izin yakın bir temas halinde olmalıdır. Bu video, hücre verimli elektrofüzyon göstermektedir<em> In vitro</em> Modifiye bağlılık yöntemi sayesinde. Bu yöntemde, hücreler, sadece biraz daha iyi yüzey takmak için izin verilir, bu orta takas ve hücreleri hala küresel şekli korumak olabilir. Fusion görselleştirme, farklı floresan hücre izci boyalarla hücrelerinin sitoplazmasında öncesi etiketleme tarafından değerlendirilir; hücrelerin yarısı, turuncu CMRA ve yeşil CMFDA ile diğer yarısı ile etiketlenir. Fusion verimi sayısı iki ile çarpılır tüm hücreleri ile bölünmüş dually floresan hücrelerinin sayısı olarak belirlenir.

Protocol

I. Hücre izci CMFDA ve CMRA hücreleri yükleme Fare melanom hücre hattı (B16-F1) önceden hazırlanmış hücreleri üzerinde deneyler yapıldı. Hücreler% 70-80% 10 fetal sığır serumu, 0.15 mg / ml 'lik L-glutamin, 16 mg ile desteklenmiş DMEM kültür ortamı izdiham (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta) için iki ayrı 25 cm 2 kültür şişeler (DYP, ZDA ) yetiştirilen / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Almanya), 200 adet / ml crystacillin (Pliva'nın Hırvatistan), 37% 5 CO 2 inkübe ° C Orijinal boya 50 mikrogram 10.76 ul ul ve DMSO (Sigma-Aldrich, Almanya) 9 (sırasıyla, Yeşil CMFDA ve Turuncu CMRA) ekleyerek iki Hücre izci 10 mM stok solüsyonları (Invitrogen, ABD) hazırlayın Invitrogen flakon. Stok çözelti 4 ° C'de birkaç ay buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar, deneyler başlamadan önce ısınmak çözüm. Bikarbonat-Krebs-HEPES tamponu (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 mM D-glukoz, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4) hazırlayın. Iki bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu 3 ml 15 ml Eppendorf tüpleri ayrı ayrı her bir stok solüsyonu 2.1 ul karışımı (10 mM CMFDA veya CMRA, sırasıyla). Bu yaklaşık çalışmada 7 mcM CMFDA (ya da CMRA) içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır. Bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu ile hücreler iki kez durulayın ve sonra şişeler içine çözümler yükleme eklemek. 37% 5 CO 2, 30 dakika boyunca hücrelerinin inkübe ° C. Bu ilk kuluçka reaktifleri hücre zarları aracılığıyla serbestçe geçiş sırasında, ama bir kez hücre içinde, reaktifler hücre geçirgenliği olmayan floresan reaksiyon ürünler haline dönüştürülür. 37 ilk inkübasyondan sonra, durulama ve% 5 CO 2, iki saat boyunca başka bir kültür ortamı ile hücreleri inkübe ° C Hem şişeler hücrelerin Trypsinize (CMFDA ve CMRA yüklü) ve 50 ml santrifüj tüpüne bir oranı 1:1 (DYP, ZDA) birlikte, kırmızı ve yeşil hücreleri karışımı. DMEM orta ile seyreltme veya santrifüj ile konsantrasyon 5 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. 24 multiwell plaka (DYP, ZDA) her kuyuda bir hücre süspansiyonu 20 ul damla yerleştirin. 37 ° C'de 20 dakika için onları biraz daha iyi yüzeyine tutunur ve hücre temas kurmak için izin vermek için% 5 CO 2 hücre inkübe edin. II. Elektrofüzyon (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 75 mM sukroz) isoosomolar potasyum fosfat tamponu hazırlayın (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 250 mM sukroz) ve hypoosmolar potasyum fosfat tamponu . Iyi altındaki hücreleri mikroskop aşamada, pozisyon üzerine elektrotlar multiwell yerleştirin ve darbe jeneratörü bağlayın. Isoosomolar potasyum fosfat tamponu 1 ml hücreleri yıkayın. Hücre şişmesi neden için 350 ul hypoosmolar potasyum fosfat tamponu ekleyin. Tampon elektrotlar kapsamalıdır. Hücreleri elektrik darbeleri uygulamadan önce 2 dakika hypoosmolar tampon içinde bırakın. Osmotik hücrelerinin iç ve dış arasındaki dengesizlik nedeniyle hücre içine su molekülleri bu kez akını sırasında hücre hacmi bir artışa neden olur. Hücreler maksimum hacim yakın Elektrik bakliyat düzenleyici seviyesini azaltmak başlamadan önce uygulanmalıdır. Optimal elektrofüzyon ulaşmak ve hücre canlılığını korumak için, elektrik darbeleri optimal parametreleri kullanılmalıdır. Bunlar [1] kullanılan hücre hattı bağlıdır. Bu deneyde, 8 dikdörtgen darbeler (1 Hz 100 s süresi her) bir tren elektroporasyon cihazı (bizim durumumuzda Cliniporator, Igea, İtalya) ile, her bir örnek uygulanır. Darbeleri iyi kontrolü dışında, bir elektrik alanı, her bir kuyunun elektrot arasındaki yaklaşık 1200 V / cm, 0.8 mm çap ve aralarında 5 mm mesafe ile iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir. 10 dakika sonra nabız teslimat için rahatsız hücreleri bırakın. Floresan, faz kontrast mikroskobu ile füzyon verimi belirleyin. III. Görüntü edinimi ve füzyon verimi belirlenmesi Hücreleri bir amacı (x20) ve soğutmalı CCD kamera (VisiCam 1280, Visitron, Almanya) ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak görülmektedir. Görüntüleri MetaMorph 7.1.1 (Moleküler Cihazlar, ABD) satın alınan, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. CMFDA 548 nm'de 492 nm'de monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve CMRA heyecanlı. CMFDA ve CMRA floresan (D605/55m C iki emisyon 535 nm 'de merkezlenmiş filtreler, bir (HQ535/30m CMFDA için) ve 510 nm dalga boyunda diğer merkezli kullanarak elde edilirMRA, Chroma, ABD) hem de. Dikroik ayna (Q515LP) kanal çapraz tartışma engelledi. Her iyi beş rasgele seçilmiş alanlar için üç görüntüleri (faz kontrast, kırmızı ve yeşil floresan) edinin. Her görüntünün üçlü üç kanal görüntüleri oluşturun. Böyle bir görüntüde floresanlama sitoplazma, hücre zarları ile birlikte görülebilir. Sigortalı hücreleri böylece [Şekil 1] kolayca tespit edilebilir. Her üç kanallı görüntü her üç tip hücre (kırmızı, yeşil ve dually floresan) güvenin. Her görüntünün tüm hücrelerin sayısı ile ikili olarak floresan hücrelerinin sayısına bölünmesiyle dually floresan hücrelerin yüzdesi belirleyin. Fusion verim yarısı erimiş hücreler tespit olmadığı için 2 ile çarpılır dually floresan hücrelerin yüzdesi olarak tanımlanır (aynı renk sigorta hücreleri). Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 elektrofüzyon sonra B16F1 hücrelerinin üç kanal mikroskopi görüntü: faz kontrast, CMRA floresan (548 nm eksitasyon) ve CMFDA floresans (492 nm eksitasyon), objektif büyütme 20x

Discussion

Non-spesifik, örneğin, dış elektrik alanları, sigorta hücre zarlarının biyoloji, biyoteknoloji, tıp ve araştırma yeteneği önemlidir. Böyle bir nonspesifik füzyon çok değerli hibrid hücreler ve monoklonal antikorlar gibi ürünler, üretim sağlar ve füzyon [2] temel mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Elektrofüzyon düzgün farklı hücre türlerine ayarlanmış olabilir çünkü potansiyel olarak çok etkili bir yöntemdir. Yakın fiziksel temas hücreleri kendi fusogenic haline getirilir Elektrofüzyon (füzyon eğilimli) yüksek voltajlı elektrik darbeleri ile elde edilir. Elektrofüzyon verimliliği elektrofüzyon sürecinin iki bölümden etkileyen çeşitli parametreler bağlıdır. Elektrofüzyon sürecinin ilk bölümü hücreleri arasındaki yakın fiziksel temas başarı, farklı yöntemler ile elde edilebilir [3-8]. Bağlılık yöntemi (izdiham için büyüyen hücreleri) verimli hücreleri arasındaki büyük bölgelerde kendiliğinden kurulan hücre kişilere bağlı olarak kullanılabilir, fakat birçok çekirdekleri ile çok büyük erimiş hücreler üretir. Hayatta kalmak için daha fazladır ve tomurcuklanmaya küçük hücreleri (çekirdekleri 2 ila 5), ​​(Şekil 1) elde edilir, modifiye bağlılık yöntemi kullanarak. Hücreleri arasındaki temas da deney [9] osmotik tedavisinde kullanılan nedeniyle, hücrelerin ozmotik şişme yarar. Elektrofüzyon sürecinin ikinci bölümü, hücre zarlarının fusogenic devletin başarısıdır. Fusogenic devlet membran electropermeabilized devlet (hücreler non-spesifik normalde sağlam zarından geçemez moleküllere permeabilize) ile ilişkilidir ve elektrik darbeleri aynı parametreler (genlik, uzunluk, sayı ve frekans) tarafından yönetilir [10] . Optimum elektroporasyon için gerekli elektriksel parametrelerin değerleri [1] ve elektrofüzyon farklı hücreler arasında farklılık hücrelerin boyutu ve biyolojik özellikleri bağlıdır. Elektrik parametreleri böylece, füzyon elde etmek için, füzyon ortağı olarak kullanılan farklı hücre hatları, için optimize edilmesi gerekir.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	Igea		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	TPP	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	TPP	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	TPP	91015
25 cm2 culture flask	Tool	TPP	90026
Electrodes	Tool	Custom made		Pt/Ir