Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

doi: 10.3791/1991 Published: July 1, 2010

Summary

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon göstermektedir

Abstract

Hücre elektrofüzyon hibrit hücrelerinin, insan tedavisi için hazırlamak için kullanılan güvenli bir non-viral ve kimyasal olmayan bir yöntemdir. Elektrofüzyon yakın temas içinde olan hücrelere kısa yüksek voltajlı elektrik darbeleri uygulama içerir. Kısa, yüksek voltajlı elektrik darbeleri Uygulama hücre plazma membranlar istikrarsızlaştırma neden olur. Istikrarsızlaştırdı membranlar farklı moleküller için daha geçirgen ve aynı zamanda herhangi bir komşu istikrarsızlaştırdı membranlar ile füzyonu eğilimli. Elektrofüzyon böylece çok farklı hücreler non-spesifik bir füzyon sağlamak için uygun bir yöntemdir

Protocol

I. Hücre izci CMFDA ve CMRA hücreleri yükleme

  1. Fare melanom hücre hattı (B16-F1) önceden hazırlanmış hücreleri üzerinde deneyler yapıldı. Hücreler% 70-80% 10 fetal sığır serumu, 0.15 mg / ml 'lik L-glutamin, 16 mg ile desteklenmiş DMEM kültür ortamı izdiham (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta) için iki ayrı 25 cm 2 kültür şişeler (DYP, ZDA ) yetiştirilen / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Almanya), 200 adet / ml crystacillin (Pliva'nın Hırvatistan), 37% 5 CO 2 inkübe ° C
  2. Orijinal boya 50 mikrogram 10.76 ul ul ve DMSO (Sigma-Aldrich, Almanya) 9 (sırasıyla, Yeşil CMFDA ve Turuncu CMRA) ekleyerek iki Hücre izci 10 mM stok solüsyonları (Invitrogen, ABD) hazırlayın Invitrogen flakon. Stok çözelti 4 ° C'de birkaç ay buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar, deneyler başlamadan önce ısınmak çözüm.
  3. Bikarbonat-Krebs-HEPES tamponu (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 mM D-glukoz, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4) hazırlayın. Iki bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu 3 ml 15 ml Eppendorf tüpleri ayrı ayrı her bir stok solüsyonu 2.1 ul karışımı (10 mM CMFDA veya CMRA, sırasıyla). Bu yaklaşık çalışmada 7 mcM CMFDA (ya da CMRA) içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır.
  4. Bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu ile hücreler iki kez durulayın ve sonra şişeler içine çözümler yükleme eklemek. 37% 5 CO 2, 30 dakika boyunca hücrelerinin inkübe ° C. Bu ilk kuluçka reaktifleri hücre zarları aracılığıyla serbestçe geçiş sırasında, ama bir kez hücre içinde, reaktifler hücre geçirgenliği olmayan floresan reaksiyon ürünler haline dönüştürülür.
  5. 37 ilk inkübasyondan sonra, durulama ve% 5 CO 2, iki saat boyunca başka bir kültür ortamı ile hücreleri inkübe ° C
  6. Hem şişeler hücrelerin Trypsinize (CMFDA ve CMRA yüklü) ve 50 ml santrifüj tüpüne bir oranı 1:1 (DYP, ZDA) birlikte, kırmızı ve yeşil hücreleri karışımı. DMEM orta ile seyreltme veya santrifüj ile konsantrasyon 5 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. 24 multiwell plaka (DYP, ZDA) her kuyuda bir hücre süspansiyonu 20 ul damla yerleştirin. 37 ° C'de 20 dakika için onları biraz daha iyi yüzeyine tutunur ve hücre temas kurmak için izin vermek için% 5 CO 2 hücre inkübe edin.

II. Elektrofüzyon

  1. (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 75 mM sukroz) isoosomolar potasyum fosfat tamponu hazırlayın (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 250 mM sukroz) ve hypoosmolar potasyum fosfat tamponu .
  2. Iyi altındaki hücreleri mikroskop aşamada, pozisyon üzerine elektrotlar multiwell yerleştirin ve darbe jeneratörü bağlayın.
  3. Isoosomolar potasyum fosfat tamponu 1 ml hücreleri yıkayın. Hücre şişmesi neden için 350 ul hypoosmolar potasyum fosfat tamponu ekleyin. Tampon elektrotlar kapsamalıdır.
  4. Hücreleri elektrik darbeleri uygulamadan önce 2 dakika hypoosmolar tampon içinde bırakın. Osmotik hücrelerinin iç ve dış arasındaki dengesizlik nedeniyle hücre içine su molekülleri bu kez akını sırasında hücre hacmi bir artışa neden olur. Hücreler maksimum hacim yakın Elektrik bakliyat düzenleyici seviyesini azaltmak başlamadan önce uygulanmalıdır.
  5. Optimal elektrofüzyon ulaşmak ve hücre canlılığını korumak için, elektrik darbeleri optimal parametreleri kullanılmalıdır. Bunlar [1] kullanılan hücre hattı bağlıdır. Bu deneyde, 8 dikdörtgen darbeler (1 Hz 100 s süresi her) bir tren elektroporasyon cihazı (bizim durumumuzda Cliniporator, Igea, İtalya) ile, her bir örnek uygulanır. Darbeleri iyi kontrolü dışında, bir elektrik alanı, her bir kuyunun elektrot arasındaki yaklaşık 1200 V / cm, 0.8 mm çap ve aralarında 5 mm mesafe ile iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir.
  6. 10 dakika sonra nabız teslimat için rahatsız hücreleri bırakın. Floresan, faz kontrast mikroskobu ile füzyon verimi belirleyin.

III. Görüntü edinimi ve füzyon verimi belirlenmesi

  1. Hücreleri bir amacı (x20) ve soğutmalı CCD kamera (VisiCam 1280, Visitron, Almanya) ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak görülmektedir. Görüntüleri MetaMorph 7.1.1 (Moleküler Cihazlar, ABD) satın alınan, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. CMFDA 548 nm'de 492 nm'de monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve CMRA heyecanlı. CMFDA ve CMRA floresan (D605/55m C iki emisyon 535 nm 'de merkezlenmiş filtreler, bir (HQ535/30m CMFDA için) ve 510 nm dalga boyunda diğer merkezli kullanarak elde edilirMRA, Chroma, ABD) hem de. Dikroik ayna (Q515LP) kanal çapraz tartışma engelledi.
  2. Her iyi beş rasgele seçilmiş alanlar için üç görüntüleri (faz kontrast, kırmızı ve yeşil floresan) edinin. Her görüntünün üçlü üç kanal görüntüleri oluşturun. Böyle bir görüntüde floresanlama sitoplazma, hücre zarları ile birlikte görülebilir. Sigortalı hücreleri böylece [Şekil 1] kolayca tespit edilebilir.
  3. Her üç kanallı görüntü her üç tip hücre (kırmızı, yeşil ve dually floresan) güvenin. Her görüntünün tüm hücrelerin sayısı ile ikili olarak floresan hücrelerinin sayısına bölünmesiyle dually floresan hücrelerin yüzdesi belirleyin. Fusion verim yarısı erimiş hücreler tespit olmadığı için 2 ile çarpılır dually floresan hücrelerin yüzdesi olarak tanımlanır (aynı renk sigorta hücreleri).

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1
Şekil 1 elektrofüzyon sonra B16F1 hücrelerinin üç kanal mikroskopi görüntü: faz kontrast, CMRA floresan (548 nm eksitasyon) ve CMFDA floresans (492 nm eksitasyon), objektif büyütme 20x

Discussion

Non-spesifik, örneğin, dış elektrik alanları, sigorta hücre zarlarının biyoloji, biyoteknoloji, tıp ve araştırma yeteneği önemlidir. Böyle bir nonspesifik füzyon çok değerli hibrid hücreler ve monoklonal antikorlar gibi ürünler, üretim sağlar ve füzyon [2] temel mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Elektrofüzyon düzgün farklı hücre türlerine ayarlanmış olabilir çünkü potansiyel olarak çok etkili bir yöntemdir. Yakın fiziksel temas hücreleri kendi fusogenic haline getirilir Elektrofüzyon (füzyon eğilimli) yüksek voltajlı elektrik darbeleri ile elde edilir. Elektrofüzyon verimliliği elektrofüzyon sürecinin iki bölümden etkileyen çeşitli parametreler bağlıdır. Elektrofüzyon sürecinin ilk bölümü hücreleri arasındaki yakın fiziksel temas başarı, farklı yöntemler ile elde edilebilir [3-8]. Bağlılık yöntemi (izdiham için büyüyen hücreleri) verimli hücreleri arasındaki büyük bölgelerde kendiliğinden kurulan hücre kişilere bağlı olarak kullanılabilir, fakat birçok çekirdekleri ile çok büyük erimiş hücreler üretir. Hayatta kalmak için daha fazladır ve tomurcuklanmaya küçük hücreleri (çekirdekleri 2 ila 5), ​​(Şekil 1) elde edilir, modifiye bağlılık yöntemi kullanarak. Hücreleri arasındaki temas da deney [9] osmotik tedavisinde kullanılan nedeniyle, hücrelerin ozmotik şişme yarar. Elektrofüzyon sürecinin ikinci bölümü, hücre zarlarının fusogenic devletin başarısıdır. Fusogenic devlet membran electropermeabilized devlet (hücreler non-spesifik normalde sağlam zarından geçemez moleküllere permeabilize) ile ilişkilidir ve elektrik darbeleri aynı parametreler (genlik, uzunluk, sayı ve frekans) tarafından yönetilir [10] . Optimum elektroporasyon için gerekli elektriksel parametrelerin değerleri [1] ve elektrofüzyon farklı hücreler arasında farklılık hücrelerin boyutu ve biyolojik özellikleri bağlıdır. Elektrik parametreleri böylece, füzyon elde etmek için, füzyon ortağı olarak kullanılan farklı hücre hatları, için optimize edilmesi gerekir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, Slovenya Araştırma Ajansı (proje J2-9764 ve program P2-0249) tarafından desteklenmiştir. Bu video "Elektroporasyon tabanlı Teknolojileri ve Tedaviler", Slovenya Ljubljana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi tarafından düzenlenen bilimsel atölye ve lisansüstü ders, ek malzeme temsil eder.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
CMRA Reagent Invitrogen C34551 Cytosolic fluorescent dye
CMFDA Reagent Invitrogen C7025 Cytosolic fluorescent dye
DMSO Reagent Sigma-Aldrich D2650
DMEM Reagent Sigma-Aldrich D5671 Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum Reagent Sigma-Aldrich F4135
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G7513
crystacillin Reagent Pliva 625110 antibiotic
gentamicin Reagent Sigma-Aldrich G1397 antibiotic
Hepes Reagent Sigma-Aldrich H0887
KH2PO4 Reagent Merck & Co., Inc. A124873 927
KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich 4248
MgCl2 Reagent Sigma-Aldrich M-8266
NaCl Reagent Fluka 71382
KCl Reagent Merck & Co., Inc. A154336 908
MgSO4 Reagent Sigma-Aldrich M2643
D-glucose Reagent Sigma-Aldrich G8270
CaCl2 Reagent Sigma-Aldrich C4901
sucrose Reagent Sigma-Aldrich 16104
Electric pulse generator Tool IGEA Cliniporator VITAE
Multiwell plate Tool Techno Plastic Products 92424
50 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91050
15 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91015
25 cm2 culture flask Tool Techno Plastic Products 90026
Electrodes Tool Custom Made Pt/Ir

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).
  2. Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).
  3. Rols, M. -P., Teissié, J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure. Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).
  4. Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. Methods in Enzymology. 220, 174-196 Forthcoming.
  5. Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions. Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).
  6. Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. Mechanically facilitated cell-cell electrofusion. Biophys J. 67, (4), 1574-1581 (1994).
  7. Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. Cell hybridization by electrofusion on filters. Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).
  8. Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip. Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).
  9. Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization. Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).
  10. Teissié, J., Ramos, C. Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes. Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).
Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).More

Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter