1) Förberedelse agarplattor Översikt: Detta protokoll använder agarplattor för två olika användningsområden. För det första agarplattor fungera som insamling av ägg ytan, äppeljuice i agarn stimulerar äggläggningen. För det andra är embryon inbäddade i agar hålls i ett fast orientering när plattorna är centrifugeras, en tillräckligt hög koncentration av agar är nödvändig för att förhindra att plattorna från sönderfallande under centrifugering. För enkelhetens skull, är en enda typ av äppeljuice agar används för båda användningsområden. Material Agar (25 g) Sackaros (25 g) Äppeljuice (250 ml) Nipagin M stamlösning (5 g metyl-p-hydroxy-bensoat i 50 ml etanol), fungerar som ett konserveringsmedel Petriskålar: för centrifugering (60x15mm) och för insamling av ägg (60×15 mm eller 100×15 mm, beroende på i farten burar som används i steg 2) Utrustning Värmeplatta Två E-kolvar I en Erlenmeyerkolv kombinera 25 g agar och 750 ml dH 2 O. Autoklav 50 min på flytande cykel. Under tiden förbereder äppeljuice lösning (steg 1,2). I en annan Erlenmeyerkolv kombinera 25 g sackaros och 250 ml äppeljuice. Värm på värmeplatta (till ca 55 ° C) för att lösa sackaros. Tillsätt sedan 15 ml Nipagin M lösning. Undvik höga temperaturer, eftersom de kommer att orsaka Nipagin att bryta ner. När agar lösningen har svalnat tillräckligt för att kolven kan hanteras för hand, kombinera de två lösningarna och blanda väl. Rör på värmeplatta tills den är jämnt blandat. Häll lösningen i petriskålar (~ 0,5 cm hög). 1 liter lösning räcker till cirka 100 små (60 mm diameter) eller 40 stora (100 mm diameter) rätter. Agarplattor ska torka i flera timmar eller över natten i rumstemperatur, annars kommer de att bli för blöt för användning. För långtidsförvaring, förvara dem insvept (i plastkärl eller Petri ärmar maträtt) vid 4 ° C. 2) Skörd embryon Översikt: Under de första 3 timmars utveckling (vid rumstemperatur), Drosophila embryon enstaka celler (inte räkna könsstamceller föregångare, den posteriort placerade stolpen celler). När väl orienterade embryon av dessa stadier är centrifugeras, de stora organeller Åtskilj med täthet längs den långa axeln av ägget. På cellularization skede är detta stora enda cell omvandlas till tusentals små celler, centrifugeringen anställd krafter kommer inte att brista dessa celler. För framgångsrik segregering av stora organeller är det därför viktigt att centrifug embryon som ännu inte har slutfört cellularization. Material Äppeljuice agarplattor Jäst klistra in (torrjäst blandas med vatten till jordnöt-smör konsistens) Utrustning Fly burar: kommersiellt tillgängliga (se nedan) eller hemlagad 1 Vuxna flugor hålls i burar som äppeljuice agarplattor fästs längst ner. Använd en storlek på petriskålar lämplig för burar som används. Att initiera en insamling av ägg, förbereda ett äpple tallrik juice agar och täcka en del med jäst pasta. Bananflugor äta jäst, i synnerhet, ger jästen näring för äggproduktion. Förekomsten av jäst och äppeljuice i agarn inducerar också äggläggningen. För att byta det gamla med det nya agarplatta, är flugan buren upp och ned och bankade på bänk ett par gånger. Flugorna kommer att falla till botten och är kortfattat desorienterade. Det ger dig ett par sekunder för att snabbt ta bort en agarplatta och ersätta den med en ny. Detta utbyte tar lite övning och detaljer beror på vilken typ sysselsatt bur. Kvinna flyger lagra spermier från tidigare parningar i intern påsar (spermathecae) från vilken sperma frigörs för att möjliggöra befruktning av ägg. När väl mat och ostört, lägger honorna ägg strax efter befruktningen, och därmed tiden för äggläggning markerar tidpunkten för befruktning och början av utvecklingen. När förhållandena inte är optimala, honorna håller befruktade ägg för rörlig gånger tidigare om. För att minimera antalet sådana mis-iscensatt embryon, är det lämpligt att kasta den första samlingen av arbetsdagen (en "pre-collection" på 30 till 60 minuter räcker). Närvaron av färsk jäst inducerar honorna att lägga dessa hålls ägg, och efterföljande ägg samlingar tenderar att domineras av äggen deponeras strax efter befruktningen. Samla ägg för upp till 3 timmar, beroende på vilken linda önskas. Sedan vid rumstemperatur cellularization slutförs efter ~ 3,5 timmar, längre samling tider är inte användbara. Mest konsekventa skiktning uppnås i unga embryon, så för rutinmässig experiment har vi för kortare samling gånger (1 timeller mindre). Ibland flyger fastnar på jäst eller till ytan på agarplatta. Ta bort dem med pincett. 3) Ta bort ägget skal från embryon Översikt: Drosophila embryon omfattas av två skyddande skikt: ett yttre lager (chorion) av protein och ett inre skikt (vitelline membran) huvudsakligen gjord av vax. De skyddar fostret mot mekaniska förolämpningar och uttorkning. Den chorion har två förlängningar (ägget trådar eller rygg bihang) som är synliga som skilda strukturer. I detta steg kommer vi att ta bort chorion genom att blötlägga äggen i 50% blekmedel. När chorion tas bort, blir embryot transparent genomlysning, vilket gör valet av specifika embryonala stadier för centrifugering. Som chorion skulle också störa många efter centrifugering förfaranden (t.ex. fixering i steg 6), borttagning av chorion nu kommer att tillåta snabb bearbetning senare. De 50% blekmedel behandling som löser upp chorion inom några minuter, men det gör inte skada embryot. Den vitelline membranet håller bleka ut. Vi kommer att fortsätta bleka behandling tills ägget filament är inte längre synliga. Efteråt kommer vi att skilja embryon från blekmedel genom att hälla embryot / blekmedel slurry genom en liten sil (en korg gjord av metallnät). Det är viktigt att inte rusa blekmedel exponering steg. Om blekmedel tvättas bort i förtid, senare steg (t ex borttagning av vitelline membranet följande fixering) kan komma att äventyras. Material: Sprutflaska med 50% blekmedel (en volym dH 2 O till en volym kommersiellt blekmedel) Sprutflaska med dH 2 O Pappershandduk Utrustning: Homemade trådkorgar gjord av plåt av rostfritt ståltrådsnät. För att göra korgar, skära rutor av ~ 2 x 2 cm ut från plan plåt och strecksats dem i mitten. Pincett för att hålla trådkorgar Analysera mikroskop inställd för genomlysning Placera agarplatta under ett dissekera mikroskop och iaktta embryon av genomlysning. Se till att identifiera ägget filament (se Figur 2A). Squirt 50% blekmedel på agarplatta, som omfattar embryon. Skaka agarplatta emellanåt för att snurra embryona runt i blekmedel. När ägget filament är synliga (vanligtvis efter 3-5 minuter, men tiderna kan variera), har chorion tagits bort framgångsrikt. I nästa steg kommer ett trådnät korg användas som sil för att skilja embryon från blekmedel. Ta trådkorg med pincett och håll den över inverterade locket på agarplatta. Locket kommer att fungera som reservoar för att fånga bleka droppar genom trådnät. Häll blekmedel / embryot slam från agarplatta genom trådnät. Om ett stort antal embryon kvar på agarplatta, spruta dH 2 O på plattan och häll dH 2 O / embryo slam genom trådnät. Om ett stort antal embryon spilla över i reservoaren, häll reservoaren innehållet genom trådnät. Peka på botten av metallnät med en pappershandduk att sudda bort all överflödig vätska. Sen sprutar dH 2 O på trådnät för att skölja bort kvarvarande blekmedel. Som beskrivits ovan kan täckplåten användas som reservoar för att återkräva embryon tvättade bort. Du kan minimera förlora embryon genom att rikta strålen med vatten från sprutflaska längs omkretsen av trådkorg. Vanliga blot bort överflödig vätska. Upprepa detta tvättsteg fem till tio gånger, tills alla blekmedel har tagits bort. Om trådkorg fortfarande luktar blekmedel, bör tvätta fortsätta. 4) Montering embryon i agar Översikt: Drosophila ägg är mycket längre (~ 500 mikrometer) än bred (~ 180 mikrometer). För att få maximal och konsekvent uppdelning av organeller under centrifugering, vi orienterar embryon så att deras främre ändar pekar mot centrum av rotationen (figur 1, 3). På så sätt de lättaste intracellulära strukturer (lipiddropparna) ansamlas i framändan i alla embryon, medan mycket täta strukturer (gula komponenter) ansamlas nära den bakre änden. Embryon in i små vertikala hål i äppeljuice agar, med den främre ändar sticker upp. Den agar håller embryo i ett fast läggning under centrifugering. Utrustning: Nål Tungsten nålar, nålar är monterade i hållaren bakåt från den typiska orientering, så att den trubbiga änden sticker ut och är tillgänglig att manipulera embryon P200 pipett Analysera mikroskop inställd för transillumination Fly pensel (liten pensel användas för att sortera vuxna Drosophila) Material: Triton Salt Solution (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml Triton X-100, fyll med DDH 2 O till 1000 ml (kan göras som en 10x stamlösning) Tvätta embryon ur trådkorg med TSS och in i en tom petriskål. Embryona ska sjunka till botten. Överför petriskål innehåller embryon i TSS på en dissekera omfattning och observera med genomlysning (embryon kommer att se liknande de som visas i Figur 4). Med hjälp av en P200 pipett, välj embryon av önskad steg och överföra dem till en liten agarplatta. Vissa stadier lätt att känna igen visuellt (figur 4, för mer information, se 1). Arbeta snabbt eftersom embryon åldras och långvarig nedsänkning (längre än 30 min) i TSS kan påverka utvecklingen. Ta bort de flesta TSS med en pipett och en Kimwipe. Ytan på agar ska vara lite fuktig vilket gör det lättare att driva embryon runt. Dock bör det inte finnas pooler av vätska kvar någonstans på tallriken eftersom överflödig vätska under centrifugeringen gör att embryon för att glida ur hålen. Med hjälp av en nål, peta vertikala hål i agar nära där ett embryo finns. Det är svårt att peta hål som är helt vertikal för att du måste hålla nålen i en vinkel för att kunna samtidigt titta i mikroskop. En mindre lutning nålen är faktiskt fördelaktigt eftersom det skapar en lätt depression / lund på ena sidan av hålet så att embryot kan lätt glida längs den och in i hålet. Det räcker att punktera ytan av agar sedan agar är mjuk nog att när ett embryo delvis sätts in i ett hål den kan skjutas in ytterligare utan skador. Se till att du känner igen främre och bakre ändar av embryon, som embryon skall föras in hålen i en konsekvent vägledning, vanligtvis med framändan upp. Den vitelline membranet i framändan kännetecknas av en specialiserad struktur, micropyle (figur 2), genom vilken spermierna kommer in under befruktningen. Använda den trubbiga änden av nålen, kan du trycka mot embryot att flytta den längs agar samt att orientera / manövrera sin bakre ände mot en punkterad hål. Tryck sedan in mot den främre änden mot hålet. Detta borde lätt glider embryot i hålet längs liten fördjupning bildas vid punktering. Som embryot lutar uppåt, tryck in den djupare ner i hålet. När helt intryckt, är embryot oftast redan är ganska lodrät. Om inte, kan du justera in embryot mer vertikalt genom att trycka på den i sidled. Om hålet inte är för stor, kommer embryot position stabilt innehas av agar hela centrifugering. Med praktiken är det möjligt att bädda in 100-250 embryon per platta. Det beror på den särskilda ansökan hur många som behövs: Om embryon som används för live-avbildning eller som donatorer för transplantation experiment, finns bara några få krävs. Om embryon skall fastställas och immunostained kommer en bråkdel förlorad under tiden efter centrifugering bearbetning, och man måste börja med högre nummer. Tänk på att embryon fortsätta att utvecklas under montering så om en smal utvecklingsstadiet önskas, till den totala tiden för montering måste hållas kort. Om det finns några embryon överblivna som inte var inbäddad, ta bort dem från plattan med en fuktad fluga borste. Doppa flyger borsten i vätska (t.ex. 1xTSS), torka noggrant över toppen av plattan (medan du tittar under dissekera omfattning) för att sopa upp alla överblivna embryon, och tvätta embryon ur borsten genom att doppa penseln i vätskan igen. 5) Centrifugering och återvinning av embryon Översikt: Plattorna överförs till svängig hinkar med en Sorvall RT7 Plus centrifug och centrifugeras i 30 min vid 4000 rpm, vilket motsvarar ~ 3000 g. Efter centrifugering är täckta med TSS. Med en nål, är embryon grävde ur hålen i agar och överföras till lämpliga fartyg via en pipett. Utrustning: Nål hållare med nål (som tidigare) Sorvall RT7 Plus med RTH750 rotor och svängig hinkar, eller motsvarande 2 Analysera mikroskop inställd för genomlysning P200 pipett Material: TSS Överföring plattorna svänga hinkar av centrifugen, agar nedåt. Se till att centrifugen är jämnt balanserad. Inställningar för centrifugering: Temperatur = 40-10 ° C, min = 4000, tid = 30 min. Efter centrifugering, placera agarplatta under dissekera mikroskop igen och täcka plattan med ett lager av TSS. Använda BLunt slutet av nålen, gräva embryon ur sina hålor. De kommer att flyta i TSS, men kommer att förbli under vatten. Embryon kommer att visas självklart lager, med en brun mössa i framändan, en klar mellersta region, och ett mörkt, grått område på den bakre änden (figur 2, 5A). Släng embryon som inte visar klara skiktning. Med hjälp av en P200 pipett, överföra den väl skiktade embryon i TSS till ett nytt fartyg, t.ex. en scintillation flaska eller mikrocentrifugrör, beroende på applikation. 6) Ytterligare behandling Beroende på tillämpning, kommer embryon därefter att behandlas på olika sätt. För direkt observation av ljus-fält eller epifluorescence mikroskopi, är embryon i buffert på en glasskiva, och monteras under en 22×22 mm # 1,5 täckglas, med 18×18 mm # 1 täckglas som distanser. För långsiktiga observationer, kan det vara nödvändigt att ersätta bufferten med Halocarbon olja 27. Om embryon skall fastställas, bör de skall överföras i steg 5,6 till en scintillation flaska. De kan sedan fastställas med hjälp av vanliga fixering tekniker 1. Dessa tekniker använder vanligtvis agitation i en heptan-metanol emulsion för att ta bort vitelline membranet. Observera att för centrifugeras embryon effektiviteten i denna devitellinization steg är låg. Det är därför lämpligt att börja med så många embryon som praktiskt eller att ta bort vitelline membranet manuellt 1. Om embryona kommer att användas vid transplantation experiment (t.ex. att ta bort en särskild organell lager från centrifugerade embryon) är de överförs till agarplattor och monteras på täckglas, med vanliga rutiner som för uncentrifuged embryon 3. Den skiktning som induceras av centrifugering är stabil i tiotals minuter. 7) representativa resultat Om centrifugering fungerade som förväntat, kommer de stora embryonala organeller sortera ut av täthet 2. Till exempel kommer de med låg densitet lipiddropparna ansamlas i framändan, med hög densitet gula blåsor kommer att ackumuleras i bakändan (figur 1, 2). Lipid droppar och blåsor gulan är lagring organeller för lipider och proteiner. Bekräftelse av densitet beroende stratifiering uppnås genom visuell inspektion av levande embryon genom genomlysning under en dissekera eller sammansatt mikroskop. Embryona ska visas som i figur 5A: Den lipiddropparna kommer att utgöra en fast brunt skikt i själva främre spetsen (en "lipid cap"), äggula ackumulering kommer att resultera i en mörkgrå zon i bakändan. Dessa två mörka lager skiljs åt av en bred klar zon som representerar andra organeller och cytoplasman. Om embryon centrifugeras efter cellularization kommer skiktning vara minimal (Figur 5C). Om ett epifluorescensmikroskop finns tillgänglig kan dessa levande, centrifugeras embryon prövas enligt UV-excitation. Under dessa förhållanden, visar äggulan intensivt blå autofluorescens (Figur 5B). En kompakt lager av autofluorescent material vid den bakre stolpen indikerar framgångsrika centrifugering och fungerar som en markör för den bakre änden. Observera att utseendet på dessa lager kommer att förändras drastiskt om embryona är fasta. Till exempel, när embryona fastställs av standard värme-eller formaldehyd fixering följt av heptan-metanol devitellinization 1, lipid droppar blir genomskinlig och lipid lagret visas vitaktig och fluffigt av starkt ljus mikroskopi, snarare än mörkbrun (Figur 5D). Äggulan autofluorescens är helt eller delvis förstörts av fixering, och blev mycket mindre intensiv eller tom omöjlig att upptäcka. Om in vivo centrifugering är anställd för att markera en viss organell är det bra att märka att organell med en fluorescerande markör för bekräftelse. Till exempel YFP fusionsproteiner riktade till mitokondrierna, har ER eller Golgi beskrivits 4. I centrifugeras embryon, dessa markörer samlas på karaktäristiska positioner längs den främre bakre axeln (figur 1). Slutligen, vissa histon fusionsproteiner lokalisera både lipid droppar och kärnor 2, och därmed kan användas för att markera dessa cellens (Figur 5 E, F) samt att övervaka skede av embryot (med antalet märkta kärnor) . Fly stammar som uttrycker markörer som nämns i detta stycke är tillgängliga från Bloomington Drosophila beståndet centrum (http://flystocks.bio.indiana.edu/). För histon H2Av, både GFP och mRFP varianter finns 5, 6 Figur 1. Separering av organeller genom centrifugering (modifierad efter 2). Centrifugering av orienterade embryon resulterar i olika skiktning(Starkt ljus). Stora organeller samlas på karaktäristiska positioner längs den främre (upp) – bakre (ner) axel: lipiddropparna (upptäcks i fasta embryon genom Nilen röd missfärgning), endoplasmatiska retiklet, Golgi och mitokondrier (upptäcks i levande embryon via YFP markörer som beskrivs i huvudtexten), äggula (som påvisas med autofluorescens). Fluorescensen bilder förvärvades av konfokalmikroskopi. Figur 2. Schematisk bild av embryon. A. ägg med äggskal och framstående filament ägg (dorsala bihang). Som äggskalet inte är genomskinlig, visas ägget jämnt mörkt. B. ägg med chorion bort. I framändan (vänster) är micropyle synlig. Beroende på utvecklingsstadiet kommer embryot inne i vitelline membranet är jämnt mörkbrun eller visa olika strukturer. Se Figure4 för exempel. C. centrifugeras embryo, orienterade som i det protokoll som beskrivs här. Lipiddropparna ackumuleras som en brun "tak" på micropyle slutet, äggula bildar ett grått lager på eller nära den andra änden. Figur 3. Schematisk beskrivning av förfarandet. Vänster: Embryon utan chorion placeras ovanpå en agarplatta och sköt med en nål i hål i agar. Denna montering ger en konsekvent vägledning för alla embryon, med främre hamnar. Höger: Efter centrifugering, embryon är skiktat. Agar är överdragen med TSS (blå) och embryon återhämtat sig från agar med nålen. När upphängd i TSS, kan embryon hämtas upp med en pipett. Figur 4. Bright ljus bilder av levande Drosophila embryon, som liknar hur de visas i steg 4,1. Embryon visas i standard läggning: framändan till vänster, bakre änden till höger, ryggsidan uppåt och ventrala sidan nedåt. En time-lapse film av tidiga embryogenesen finns som en del av videon som medföljer detta protokoll. A. Cleavage stadium embryon som är jämnt brun. Stadier gillar det här är idealiska för in-vivo centrifugering. B. BLASTODERM embryon har en tydlig kant som visas liknande på alla sidor. Denna tydliga periferin är delvis på grund av ansamling av kärnor i plasmamembranet och delvis på grund av aktiv transport av äggula blåsor och droppar lipid 7. Denna tydliga periferin expanderar tills i slutet av cellularization 1. Embryon kan fortfarande framgångsrikt stratifieras genom centrifugering fram till slutet av cellularization 8, men skiktning av äggula och kärnor är inte lika konsekvent som i klyvning steg. C. Efter cellularization, embryon förekommer asymmetrisk, rygg-och ventral sidor blir tydliga, och olika veck utvecklas. Embryot som visas är i början av grodd-band förlängning. I dessa stadier är centrifugering inte längre effektiva på att stratifiera den stora organeller. Figur 5. Centrifugeras embryon. Alla embryon i denna siffra var centrifugeras med framändan upp och visas med annan riktning. A. Ljus-ljus bild av ett framgångsrikt centrifugeras embryo. En brun lager vid mycket framändan beror på lipid-droppe ackumulering. En bred grått lager nära den bakre änden på grund av äggula blåsor. Det finns ofta en klar zon under äggulan skikt, med okänt ursprung. En gulaktig zon är ofta uppenbart ovanför äggulan lagret, det förmodligen representerar mitokondrier. Lösliga proteiner finns i hela tydliga skikt mellan lipid droppar och äggula 2. B. embryo i ett ses av epifluorescence mikroskopi under UV-excitation. Den blå autofluorescens kännetecknar äggula hjälper till att identifiera den bakre änden. C. Embryo centrifugeras under grodd-band förlängning, dvs efter cellularization. Äggula kan fortfarande samlas i bakändan, men annars skiktning är minimal. D. framgångsrikt stratifierat embryo, efter värme fixering. Den lipid-droppstorlek lagret är vit och fluffig, snarare än mörkbrun som i ofixerade embryon (A). E. & F. Embryon som uttrycker His2Av-GFP och avbildat av konfokalmikroskopi (modifierad efter 2). E: centrifugeras vid klyvning steg; His2Av-GFP verkar bara markera lipid-droppstorlek lager eftersom få kärnor bildas vid denna tid. Beroende på fokalplanet kan kärnor syns knappt droppen lagret (visas inte här). F: centrifugeras vid BLASTODERM steg; His2Av-GFP markerar både lipid-droppstorlek lager (överst) och kärnor (i en bred zon under droppen lagret).