在这个视频,多色共焦成像时间推移和有针对性的细胞消融技术。定时成像是用来监测多种细胞类型的利益的行为<em>在体内</em>。有针对性的细胞消融有利于研究神经回路的功能和细胞特异性神经再生范例。
高分辨率时间推移斑马鱼幼虫生活的成像可以利用可视化的生物过程如何展开(审查见 1) 。复合转基因鱼在邻近的细胞类型表达不同的荧光记者提供的细胞相互作用2和/或组织水平反应随着时间的推移实验操作的一种手段。在这段视频中,我们证明成像transgenically多个标记的细胞类型,可用于在个别鱼随着时间的推移的课程,可以跨越从几分钟至数天连续的方法。描述的技术适用于任何研究,寻求相关邻近的细胞类型的“行为”随着时间的推移,包括:1)串行“抓了又放”的成像方法大量的鱼,连续几天,2)分离的简化方法重叠的激发/发射的配置文件(如GFP和YFP),3)使用的色素减退突变线延长的时间窗口,可用于高分辨率成像到后期幼体阶段的发展,4)使用有针对性荧光记者透露的膜的荧光基团与罚款形态详细的单个细胞,以及在人口较多的细胞的细胞细节,和5)先前所描述的方法诱导化学消融transgenically有针对性的细胞类型,即nitroreductase(NTR)介导的药物前体基板的转换,如甲硝唑(MTZ),3,5细胞毒素衍生物。
由于这些方法的一个例子,我们将可视化的数天在个别鱼类的视网膜双极神经元亚型的消融和再生。同时,我们会密切留意其他几个视网膜细胞类型,包括邻近的非针对性的双极细胞和潜在的变性刺激视网膜干细胞(即,Mϋller神经胶质细胞)。这一战略被应用在我们的实验室来表征细胞和组织水平(例如,干细胞小生境)的反应选择性的损失和有针对性的神经细胞类型的再生。
在这段视频中,我们多色共焦成像时间推移和有针对性的细胞消融技术的概述。我们聘请的时间推移成像监测的多种类型的细胞在体内的兴趣行 为,而有针对性的细胞消融是用来研究神经电路功能和细胞特异性的神经再生的范例。这些例子所示突出,可以从这些方法中收集的几个优点。也许最显着,时移成像提供了内部控制的范式;任何及所有现象的观察,可以恢复到以前的状态有关。这使得在实验时间点,直接,而不是推断比较相对变化比较容易量化和减少实验的“噪音”内人口的变化相关。多色成像的优势是可视化交互和/或邻近的细胞类型的变化的能力。例如,使用一个标签米勒的神经胶质细胞的转基因株系,我们现在这些潜在的伤害诱导干细胞特征的离散的视网膜细胞亚群的损失。我们还用这种方法来定义新机制的神经回路的形成2。最后,除了细胞再生的研究,我们最近开始使用消融系统的正常贸易关系为基础的调查从而使用各种行为模式和电生理检测的离散神经回路神经元亚型的职能作用。采用这样的研究斑马鱼的独特优势在于,由于其再生能力,诱导赤字是暂时的。因此,通过时间推移成像检测相关,我们可以典型的神经再支配的机制,导致,以及神经再支配的程度,功能恢复所需。
提供的方法可以适应许多不同的问题。例如,消融和再生的类似分析,可以应用到任何transgenically自定义的细胞亚型。总的来说,这些研究潜力,扩大在单个细胞类型的水平,并在离散的干细胞龛的再生的认识。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢博士。米拉Saxena先生和乔纳森有益的意见对稿件恩威。我们感谢博士。迈克尔帕森斯,东区雷蒙德,汪楚萍提供转基因株系。根据批准的协议07-12-003由MCG的IACUC规定的准则和法规进行动物实验* B。这项工作是由美国国立卫生研究院R21 MH083614和3月角钱罗勒Ø康纳入门学者奖的JSM支持
1. Reagents:
Danieau’s solution:
Other reagents:
2. Supplies:
3. Equipment: