Multicolor Time-lapse avbildning av Transgena Zebrafish: Visualisering Retinal Stamceller Aktiveras genom riktade neuronal cell Ablation

Summary

I denna video, är tekniker för multicolor konfokala tidsförlopp bildanalys och målsökande cell ablation tillhandahålls. Time-lapse avbildning används för att övervaka beteendet hos flera celltyper av intresse

Abstract

Högupplöst tidsförlopp avbildning av levande zebrafisk larver kan utnyttjas för att visualisera hur biologiska processer utvecklas (för granskning se ^1). Sammansatta transgen fisk som uttrycker olika fluorescerande reportrar i grannlandet celltyper ger ett sätt att följa cellulära interaktioner ² och / eller vävnad nivå svar på experimentella manipulationer över tiden. I denna video visar vi metoder som kan användas för avbildning flera transgenically märkt celltyper som serie i enskilda fiskar över tiden kurser som kan spänna från minuter till flera dagar. De beskrivna tekniker är tillämpliga på någon studie som syftar till att korrelera "beteende" av angränsande celler typer över tiden, bland annat: 1) serie "catch and release" metoder för att avbilda ett stort antal fiskar under flera dagar, 2) förenklade metoder för att separera fluoroforer med överlappande excitation / emission profiler (t.ex., GFP och YFP), 3) användning av hypopigmenterade mutant linjer för att förlänga tiden fönstret för högupplöst bildbehandling i sena larvstadier av utveckling, 4) användning av membranet riktade fluorescerande reportrar att avslöja fina morfologiska detaljer i enskilda celler och cellulära detaljer i större populationer av celler, och 5) en tidigare beskrivna metoden för kemiskt inducerad ablation av transgenically riktade celltyper, dvs nitroreductase (NTR) medierad omvandling av prodrug substrat, såsom metronidazol (MTZ), till cytotoxiska derivat ^3,5.

Som ett exempel på dessa metoder, kommer vi att visualisera ablation och förnyelse av en subtyp av näthinnan bipolära neuron inom enskilda fiskar under flera dagar. Samtidigt kommer vi att övervaka flera andra retinala celltyper, inklusive angränsande icke målinriktade bipolära cellerna och potentiella degenerering-stimulerad retinala stamceller (dvs Mϋller Glia). Denna strategi tillämpas i vårt labb för att karaktärisera cell-och vävnads-nivå (t.ex. stamceller nisch) svar på selektiv förlust och förnyelse av riktade neuronala celltyper.

Protocol

1. Transgena och Mutant Lines

1. Upprätta / förvärva transgena zebrafisk linjer som har celltyper av intresse differentiellt märkta med fluorescerande reporter varianter. Optimalt ska excitation / emission profil för de utvalda journalisterna har minimal överlappning (t.ex. ECFP och EYFP), vilket emellertid inte är absolut nödvändig. För våra syften, tjudrade användning av membranet fluorescerande reportrar avsevärt underlättar avbildning av fina cellulära detaljer, såsom neuritic processer, till att en individuell cell nummer och / eller morfologier i stora comingled grupper och för att "markera" regioner med hög membran innehåll, t.ex. synaptisk neuropils.
2. För avbildning i sena larvstadier, är det bra att dra / cross transgena linjerna till mutant bakgrunder som reducerar pigmentering [t.ex. Roy Orbison (Roy) eller Roy Orbison, albino (Roy, alb), ^4]. Enligt vår erfarenhet är minskningen av iridiphores (t.ex. Roy) den mest kritiska frågan, kan melanogenesis behandlas kemiskt med hjälp av 1-fenyl 2-thiourea (PTU) eller med "albino" mutanter som saknar melanophores. Observera dock att Ren et al. ^4, har visat visuella brister och måttliga morfologiska förändringar i näthinnor av fisk saknas melanaphores, och att intensivt ljus kan inducera fotoreceptor död i "albino" mutanter. Således är dessa frågor måste tas i beaktande vid utformningen imaging experiment och / eller tolka data.
3. För denna demonstration var transgena och muterade fisk som används rader:
   1. Tg (NYX: Gal4-VP16) ^{q16a / +,} Tg (UAS: gap43-YFP) ^{q16b / +,} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{c264 / +,} Tg (pax6-DF4: gap43-GFP) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Anmärkning: I fisk "1", en subpopulation av NYX-promotor definieras retinal bipolära celler uttrycker en membran-märkta YFP och / eller en NTR-mCherry fusion reporter (mest uttrycka båda), och nästan alla näthinnans celler uttrycka ett membran-märkta gemensamma fiskeripolitiken . Fish "2" är som ovan förutom Müller gliaceller uttrycka cytosoliskt GFP och globala näthinnan GFP uttryck har eliminerats. Redovisning av NTR-mCherry fusion gör NYX definierade bipolära celler mottagliga för prodrug-inducerad ablation ^3,5.

2. Välja och förbereda Embryon / larver för Live Imaging

1. Mate transgena / mutant linjer av intresse, samla ägg och ruva / bibehålla vid 28,5 ° C i 0.3X Danieau lösning (eller "embryo medium" val).
2. Om inte i en "albino" bakgrund bör PTU läggas till hämma tyrosinas verksamhet före några tecken på pigmentering i vävnaden av intresse (t.ex. ~ 16 HPF för ögat, 200 mikroM slutlig). Observera att behandling med PTU i koncentrationer som överstiger 75 mikroM kan orsaka toxicitet och / eller teratogena effekter. Men eftersom ögat är mycket pigmenterade, behandlingar under 200 mikroM inte är tillräckliga för högupplöst konfokala imaging, under dessa förhållanden är det viktigt att välja hälsosamma letar fisk för avbildning. För bildbehandling andra vävnader kan 75 mikroM PTU vara att föredra. Också, som nämnts ovan, användning av "albino" mutant linjer undanröjer behovet av att behandla embryon med PTU och är en prioriterad strategi för bildhantering i sena larvstadier.
3. När fluorescerande reportrar är uppenbara, sortera fisk enligt transgenen uttryck och allmän hälsa med hjälp av en fluorescensmikroskop stereo zoom eller liknande.
4. Före den första dagen av bildbehandling, lös låg smälta agaros (LMA) i embryo medellång till en slutlig koncentration av 0,5%, värme och blanda för att få in lösningen förvaras vid 40 ° C.
5. På den första dagen för bildframställning, förbereda monteringslösning: Lägg tricaine (ett bedövningsmedel, 756 mikroM slutlig) och PTU (om nödvändigt) till 0,5% LMA i embryo medium, blanda försiktigt, och återgå till 40 ° C.
6. Bedöva fisk genom att överföra in i embryot medium som innehåller PTU och / eller tricaine, ge tid för fisken att bli icke-känslig för beröring (~ 3 min).
7. Överför fiskar i monteringslösning, noga med att inte späda ut agaros så att den kan återanvändas. Vi använder en mikropipett med klippta tips för att överföra, vilket också bidrar till att upprätthålla en kontrollerad volym (~ 30 mikroliter). Efter förvärvet, vänd pipett och låt fisken till botten så att vidröra spetsen på monteringslösning låter gravitationen överföring utan behov av att skingra alla vätska.
8. Efter överföring, utvisa bedövande lösning från mikropipett och använda den för att överföra fisken i en ~ 30 mikroliter droppe montering lösning till en petriskål.
   Notera: Denna monteringsmetod är endast relevant för upprätt mikroskopi där långa arbetsavstånd nedsänkning i vatten mål kommer att användas. För migthods relevanta för omvänt mikroskop, där täckglas krävs, se Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden och Sive, 2009.
9. Återgå monteringslösning till 40 ° C värmeblock.
10. Använda en ögonfrans borste eller liknande försiktigt rotera fisk i önskad riktning och position i regionen av intresse i mitten av agarosen droppen.
11. Upprepa steg 6 till 10 för att montera det önskade antalet embryon per maträtt. För seriell tidsförlopp experiment (se nedan) som vi monterar normalt sex fiskar i taget och försöka begränsa avbildning sessioner till 1 timme per grupp.
12. Medan montering andra fiskar tillbaka för att se tidigare ämnen upprätthålla önskad riktning tills agaros stelnar (~ 3 min).
13. Efter agaros har stelnat, transport fisk till konfokalmikroskop scenen och försiktigt lägga embryo medium som innehåller PTU och / eller tricaine till skålen tills alla fiskar är helt under vatten.

3. "Multicolor" in vivo Confocal Imaging

OBS: Vi har försökt att generalisera protokollet nedan så att den ger relevant information för andra mikroskop konfigurationer. Specifika hänvisningar till Olympus och ImageJ programvara är inom citationstecken. Vårt Imaging System är en Olympus FV1000 upprätt konfokalmikroskop utrustad med 405, 440, 488, 515, 559 och 635 lasrar nm, två rörliga spärrfilter upptäckt kanaler (tillåter utsläpp våglängd inställningar justeras i 1 nm steg), en standard barriär filter kanal (för röd och långt rött bildbehandling), och ett ljus kanal.

1. Öppna bildprogram ("FV10-ASW") och använder antingen överförs eller fluorescerande ljuskällor att lokalisera regionen av intresse. För optimal avbildning av cellulära och / eller molekylär detalj använda långa arbetsavstånd mål med hög NA (t.ex. 60X, 1.2NA).
2. Om samla genomlysning bilder, fokus fältet membran för Kohler belysning.
3. Välj lämplig fluorphores från "Dye List" eller ladda förvärv parametrar från en tidigare sparad bildfil. Justera utsläppen varierar ("Spectral Setting") som är nödvändiga för ren separation av reporter signaler och / eller maximal signal-brus-förhållande. Dessa inställningar kommer att behöva empiriskt definieras för varje experiment för att minimera överhörning men maximera signal; inställningar för de exempel som ges här visas nedan:

   Flourphores	Lasrar (nm)	Barrier Inställningar / Emission Filter (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP **, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Imaging av mCherry skulle kunna förbättras med en högre våglängd laser (t.ex. 568 eller 594 nm)
   ** En sekventiell imaging-läge tillåter dikroiskt spegeln och spärrfilter förändringar ("virtuella kanaler") krävs på grund av utsläpp / excitation överlappning mellan GFP och YFP. GFP och mCherry kan tilldelas en kanal YFP till en separat kanal. Obs: överhörning mellan GFP och YFP bilder kommer att märkas innan Image Subtraktion (Del 6).
4. Se målet som används har valts i rullgardinsmenyn för att se all programvara definieras förinställningar är rätt justerade.
5. Att fokusera lasrar och ställa effektnivåer, väljer du en Look Up Table (LUT) som avslöjar pixel mättnad ("Hi-Lo") för varje kanal. Ställ in detektorns känslighet ("HV", PMT spänning) till ett värde överensstämmer med önskad bildkvalitet (definierad empiriskt) och öka gradvis laserutskrifter tills bilden intensitet är acceptabelt att undvika pixel mättnad.
6. Kontrollera om överhörning mellan kanaler, se till att varje laserlinje producerar detekterbar signal endast i lämplig kanal genom att manuellt vrida laser på och av samtidigt övervaka alla avbildning kanaler. För att eliminera överhörning minska lasereffekt. Om ingen överhörning är självklart kan alla kanaler att förvärvas samtidigt ger betydande tidsvinster.
7. I händelse av oundvikliga överhörning, använd en "sekventiell" imaging läge som växlar mellan laser / kanalerna individuellt. Extrema fall (t.ex. imaging GFP och YFP) kräver användning av sekventiella lägen som också växla dikroiskt speglar och / eller filter barriär ("virtuella kanaler"). Obs: det här alternativet innebär betydande tidsmässiga förseningar i bilden förvärvsprocessen och får inte APpropriate för att fånga mycket dynamiska processer.
8. "Zoom" och "Rotation" funktioner kan användas för att ytterligare rama in området av intresse. Zoom kan också användas för att förbättra bildupplösning, upp till gränsen av det mål och skanna format som används (t.ex. 512 x 512, se för information om dessa frågor, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. För in vivo imaging i allmänhet och särskilt viktiga för tidsförlopp bildbehandling, tekniker som minimerar fototoxicitet frågor (dvs ansamling av fria radikaler) måste framhållas, snabb skanning hastigheter (t ex 2 uS / pixel) och låg laserutskrifter nivåer (t ex 1%) bör användas när det är möjligt, samt den lägsta upplösningen Scan-format tillräcklig för att fånga framträdande information.
10. För att förbättra bildupplösning, skanna genomsnitt ("Kalman") kan användas under förvärvet. Långsammare skanningshastigheter också förbättra upplösningen men öka laser uppehållstid, vilket kommer att förvärra fototoxicitet och blekning frågor. Observera att båda dessa synsätt är inte idealiskt för time-lapse på grund av risken för oförmåga att fånga upp snabba förändringar i en Z-serie, ett fenomen som vi kallar "tid suddas ut". Observera att i genomsnitt för rad jämfört med ram kan bidra till att eliminera "tid oskärpa" frågor inom ett enda plan, men inte över z-djup.
11. Om signalen intensitet är låg och maximal upplösning är inte nödvändig (t ex att helt enkelt räkna cell nummer), öka konfokala bländare (hål diameter) kan användas för att förstärka signalen. Detta tjänar till att hålla laser intensiteter låga, vilket minskar fototoxicitet och blekning, men justera bländaren till ett värde större än 1 luftig enhet leder till snabb förluster i bildkvalitet.
12. Definiera z-djup dimensioner med hjälp av en snabb scan-läge ("Focus x4"). Eftersom signalintensiteten generellt minskar med z-djup är det bäst att börja z-stack förvärv till lägsta djup och slutar vid de mest ytliga, ger detta svårare signaler som kan förvärvas innan betydande blekning inträffar.
13. Kontrollera att signalstyrkan är tillräcklig upptäcka hela djupet i bilden. Om så önskas kan ett z-dimension ljusstyrka korrigering funktion ("Bright Z") användas för att justera parametrar bildtagning vid angivna djup.
14. Ställ in z-dimensionen steg storlek beroende på experimentella behov. Till exempel i vårt första exempel (Figur 1) var vi helt enkelt ta en "cell folkräkning" i enskilda näthinnor under flera dagar, vilket vi sätter z-djup till 15 mikron och tog 5-7 bilder per näthinnan. Denna strategi gjorde att vi kunde ta stickprov av varje näthinnan utan cellulära överlappning mellan bilderna. I vårt andra exempel (figur 2) utförde vi en snabb 4D tidsförlopp filmer där GFP och mCherry signaler behövde rumsligt korrelerade, så vi satte steget storleken till tre gånger den teoretiska lateral upplösning en kompromiss som tillät z-stack bilder som ska tas varje 5-10 minuter men ändå tjänat till att lösa enskilda cellulära detaljer.
15. Hämta bilder ("XYLZt") och spara. Gå vidare till nästa fisk om att utföra en serie tidsförlopp experiment (se # 4 nedan). För snabb tidsförlopp imaging se # 5 nedan.

4. Seriell "catch and release" Imaging: en metod för att spåra cellförändringar fiskar under flera dagar

1. En "catch and release"-protokollet används för att minimera den tid fisk är immobiliserade och att öka antalet fiskar avbildade per försök. Nyttan med denna teknik är begränsad till biologiska processer som utvecklas under dagarna (t.ex. Mumm et al. 2006 ^2). En fördel med denna metod är att den tillåter eventuella observerade förändringar vara internt kontrolleras, dvs jämförelser mellan olika tillstånd av individer snarare än alla befolkningsgrupper. Till exempel spåra ändringar i antalet märkta celler förekommer i en viss vävnad kan utföras noggrant även om antalet celler initialt märkt varierar mycket mellan olika fiskar. Metoder för att använda detta protokoll inom ramen för en prodrug-inducerad cell ablation analys ^3,5 ges här.
2. Att visualisera ablation och förnyelse av riktade celltyper i enskilda fiskar över tiden, konfokal bilder förvärvats före prodrug administrering (före behandling), omedelbart efter prodrug borttagning (efter behandling) och under återhämtningsperioden (Recovery bilder).
3. Förbehandling avbildning: Fisk är monterade och avbildat som ovan. När fisk har avbildat de släpps ut i embryo medelstora (+ prodrug) och inkuberas vid 28,5 ° C tills Post-behandling avbildning session. Att arbeta i lag om två, ett montage och släppa fisk, den andra är imaging ett bra sätt att maximera antalet fiskar som kan avbildas per dag.
4. Efter bildbehandling all fisk i en enda maträtt ersätta embryot medium som innehåller tricaine embryo medelstora ensam (+ / - PTU).
5. För att frigöra fisk, använd juvelerare pincett för att skära igenom agaros på båda sidor av larver och sedan försiktigt reta agaros borta tills fisken svävar fritt i embryot medium.
6. Prodrug-inducerad ablation: Överför larver i en enskild brunn i ett multispot skylt som innehåller embryot medel (+ / - PTU) + prodrug (t.ex. 10 mM metronidazol, MTZ). För att säkerställa korrekt slutgiltiga prodrug halter vi normalt alikvot en definierad volym av embryo medel (+ / - PTU) som innehåller en 2X koncentration av prodrug (t.ex. 20 mm) i varje brunn. Fisk är sedan till brunnarna i en lika stor volym embryo medel (+ / - PTU) att få den slutliga prodrug koncentrationen till 1X.
7. Inkubera vid 28,5 ° C tills riktade cell ablation kan verifieras.
   Obs: prodrug behandlingsregimer krävs för att uppnå en framgångsrik ablation varierar beroende på celltyp riktade, prodrug koncentration och behandlingstid måste bestämmas empiriskt, vara medveten om att höga halter orsakar allmän toxicitet, t ex> 10 mm MTZ. Dessutom kan perdurance av fragmenterade reporter signaler försvårar bedömningar av ablation framgång, i vissa fall konfokalmikroskopi krävs för att tillräckligt visualisera cell förlust.
8. Efterbehandling avbildning: Fisk är monterade så att samma vävnad är optimalt orienterat och avbildat som ovan. När alla fiskar på en viss platta har avbildat de släpps ut i embryo medel (+ / - PTU) i enskilda brunnar (som ovan) och inkuberas vid 28,5 ° C för att möjliggöra förnyelse av den borttagen celltyp.
9. Beroende på ålder av fisken och tid som krävs för återvinning kan det vara nödvändigt att mata fiskarna under detta skede av analysen. Vi använder levande foder som paramecia eller hjuldjur för att säkerställa optimal överlevnad. Det är också lämpligt att ge nya medier dagligen, särskilt om fisken hålls i låga volymer (t ex 96 brunnar).
10. Återhämtning avbildning: Att dokumentera kinetik cell ersättning, kan fiskarna avbildas på en daglig basis under återhämtningsperioden. När kinetik har fastställts att analysen kan förenklas genom att förvärva återhämtning endast bilder vid tidpunkten intressanta platser (t.ex. fullständig återhämtning). Figur 1 ger ett exempel på denna strategi från våra studier av näthinnan cellförnyelsen.
11. Vid slutet av försöket fisk bör avlivas genom nedsänkning i 20X tricaine (15,3 M) lösningen på is.

5. Snabb Time-lapse Imaging.

1. För snabb tidsförlopp imaging (dvs "filmer") av flera fluorphores, tekniker som minimerar fototoxicitet frågor är avgörande (se ovan). Som nämnts ovan är denna teknik lämpar sig bäst för fluorphores tillåter samtidig, snarare än sekventiell, bildbehandling
2. Behåll fisk vid 28,5 ° C med en uppvärmd skede, ITO glas värmeelement, eller liknande.
3. Använd metoder som minskar avdunstningen för att hjälpa till att stabilisera temperatur och osmolaritet (t.ex. O-ring förseglad täckglas för omvänt mikroskop).
4. Om du använder automatisk registrering under längre tid måste du ställa bunten storlek för att medge tillväxt och / eller driver i z-dimensionen.
5. Ställ in tidsintervall och antal skanningar ("TimeScan" eller "TimeController"). Förvärv räntor måste fastställas empiriskt enligt dynamiken i den biologiska processen avbildas och / eller anpassas efter de fototoxisk känslighet egenskaper cellpopulation.
6. Hämta bilder ("XYLZt" knappen) och spara.
7. Att konstruera "filmer" kommer intressanta områden måste definieras och anpassas, x, y och z dimensioner. Hela processen är utanför ramen för detta protokoll översyn, men flera program finns tillgängliga som också underlätta zoom, rotation och panorering funktioner under 4D bild Montering (Volocity, Amira, etc.).

6. Spectral Separation Bildbehandling med ImageJ Freeware

1. Optimalt när du utför en multi-reporter experiment bildbehandling är det bäst att använda fluorphores som är väl separerade spektralt. Detta är dock inte alltid praktiskt och / eller möjligt. Här erbjuder vi en förenklad metod för att separera fluorphores som har överlappande excitation och emission profiler, i detta fall GFP och YFP. I den medföljande exempel har vi använt tidsförlopp imaging tekniker som beskrivs ovan för att spåra beteende GFP-märkta retinal "stamceller", Müller Glia under riktade ablation och förnyelse av näthinnans bipolära celler märkta med YFP och NTR-mCherry (Figur 2).
2. Samla bilder med sekventiella avbildning lägen och variabla filter barriär som gör att överlappande fluoroforer som skall förvärvas självständigt och delvis separerade, (se ovan för GFP / YFP inställningar exempel). För att ta bort överhörning använder vi en enkel bild subtraktion strategi som tar bort en kanal signal från en annan.
3. Bild Subtraktion Process: Install den senaste versionen av ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Bio-format verktyg (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) och justera travar plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Använd Loci Bio-format Importera plug-in för att öppna bildfiler, att helt enkelt dra filen av intresse på ImageJ fönstret kommer att starta importen verktyget. Dela upp kanalerna i enskilda staplar med "Split Channels"-rutan i import-fönstret eller "Split Channels"-fliken under "Kanal Verktyg" (Skift + Ctrl + z) efter lastning.
5. Starta Rikta 3 TP plugin (plugins> Justera stackar> Justera 3 TP). Den stackar måste anpassas för att säkerställa korrekt subtraktion. Markera referensen stacken i den första listrutan och mis-linje stack i den andra. Kolla "användning xy relativa ursprung" och "använda z relativa ursprung" rutor och klicka "OK".
6. För att starta justeringen, klicka på "Volume registrering" knappen. Ett nytt fönster kommer att visas som innehåller anpassning parametrar. Detta avsnitt har optimerats av distributören av insticksprogrammet, inga ändringar är nödvändiga, klicka på "OK".
7. När du är klar, kommer en "alliansfria Stacks" fönster. Välj "Output" från Rikta fönstret och Output-fönstret ska visas. Detta fönster är också optimerad och behöver ingen modifiering. Klicka på "OK". En ny skorsten ska visas i arbetsytan med "alliansfria" läggs till i slutet av filen titeln.
8. Överhörning kommer att tas bort med hjälp av "Bild Calculator" (Process> bild Calculator). Välj stacken skall dras i Bild1 listrutan och stack som används i subtraktion i Bild2 listrutan. Välj "Subtrahera" i Operation listrutan och klicka "OK". ImageJ kommer att be att bearbeta stacken, välj "Ja". En ny skorsten ska visas som har tagit bort överhörning mellan överlappande kanaler.
9. För att återskapa samma bild struktur innan justeringen och subtraktion travar behöver slås samman. Välj "Slå ihop kanaler" i Kanal Verktyg fönster. Verktyget ger dig möjlighet att slå ihop upp till fyra staplar i ett HyperStack.
   OBS: För att slå ihop mer än 4 staplar, sammanfogar travar i önskad ordning med SAMMANFOGA verktyg (bilder> staplar> Verktyg> sammanfogning). Konvertera sammankopplade stack till en HyperStack (bilder> HyperStack> stack till HyperStack). Sammansättning av stackar ändrar djup, tid, kanal (zct) ordning, detta måste återställas inom listrutan som visas, ange "ordning" att xyztc, ställ "kanaler", "skivor" och "frames" enligt Antalet staplar, djup stack och antal tidpunkter, respektive ..
10. Slutligen, alla kanaler måste färgläggas, justerat för ljusstyrka och kontrast, och sparas som TIFF-filer. Härifrån är konvertering till RGB, montage, z-projektion, eller tidsserier samma process som för de ursprungliga filerna.

7. Representativa resultat

Figur 1. Ett tidsförlopp serie konfokala bilder att visa riktade förlust och förnyelse av NTR-mCherry uttrycker retinala bipolär celler (röda blodkroppar). A & A) Före behandling finns mosaik uttryck av membran taggade-YFP reporter i "kontroll" bipolära celler, som visas i gult och nitroreductase-Cherry fusionsprotein i "riktade" bipolars visas i rött. B & B ') Efter behandling med metronidazol, den röda nitroreductase-uttryckande bipolära celler, går förlorade, medan den gula "kontroll" bipolär cellerna skonas. Detta visar den mycket speciella karaktären av detta ablation metod. C & C ") När metronidazol är borttagen, NTR-uttryck (röd) celler tillbaka.

Figur 2. Ger ett exempel på den bild subtraktion process som gör att GFP och YFP vara rent separeras efter förvärvet. A & A) Före subtraktion, GFP (grön) och YFP (pseudocolored lila) bilderna är i linje. B & B) Den subtraktion processen tillåter YFP-märkt bipolära celler som skall bort från GFP bilden, vilket gör att GFP-märkta Müller Glia vara lättare att upptäcka. C & C) Co-uttryck av GFP (grönt) och mCherry (röd) är tydlig i cellen som anges av pilen. Då samtidig uttryck för Müller Glia cellen markör och bipolär cell markör antyder att bipolär cell ablation triggers Müller Glia att ersätta den förlorade celler. Denna tolkning är i linje med senaste studierna av näthinnans förnyelse som implicerade Müller Glia som skada som orsakas av "stamceller" i både däggdjur och fiskar.

Discussion

I den här videon är en översikt av tekniker vi använder för multicolor konfokala tidsförlopp bildanalys och målsökande cell ablation tillhandahålls. Vi använder tidsförlopp imaging att övervaka beteendet hos flera celltyper av intresse in vivo, medan riktade cell ablation används för att studera neurala kretsar funktion och cell-specifika neuronala paradigm förnyelse. Exemplen belysa flera fördelar som kan samlas ihop från dessa metoder. Kanske mest väsentligt, ger tidsförlopp imaging en internt styrd paradigm, alla eventuella observerade fenomen kan relateras tillbaka till tidigare tillstånd. Detta möjliggör direkt snarare än dra slutsatsen jämförelser kan göras över experimentell tidpunkter, vilket gör relativa förändringar enklare att kvantifiera och minska experimentella "brus" i samband med variationer inom en population. En fördel med multicolor avbildning är förmågan att visualisera förändringar i samverkande och / eller angränsande celltyper. Till exempel med hjälp av en transgen linje som etiketter Müller Glia är vi som kännetecknar nu svar av dessa potentiella skador som orsakas av stamceller till förlust av diskreta näthinnans celler subpopulationer. Vi har också använt denna metod för att definiera nya mekanismer av neural krets bildas ^2. Slutligen, utöver studier av cellulära föryngring, har vi nyligen börjat använda NTR-baserade ablation för att undersöka den funktionella rollen av neuronala subtyper därmed diskret nervbanor med hjälp av olika beteende-paradigm och elektrofysiologiska analyser. Den unika fördelen med att anställa de zebrafisk för sådana studier är att, på grund av deras förnyelseförmåga, framkallade underskotten är tillfälliga. Genom att korrelera med tidsförlopp imaging-analyser kan vi typiska reinnervation mekanismer som leder till, liksom omfattningen av reinnervation krävs för funktionell återhämtning.

Den som metoderna kan anpassas till många olika frågor. Till exempel kan liknande analyser av ablation och förnyelse tillämpas på alla transgenically definierbara cellulära subtyp. Tillsammans sådana studier har potential att öka vår förståelse av förnyelse i nivå med de enskilda celltyperna, och inom diskret stamceller nischer.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).