Summary
יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.
Abstract
מדידה מדויקת של חלוקת התא היא אתגר בסיסי בביולוגיה ניסויית זה הופך מורכב יותר ויותר לאט כאשר התאים המתחלקים מנותחים. שיטות הוקמה כדי לזהות חלוקת התא כוללים להדמיה ישירה על ידי מיקרוסקופית מתמדת תרבית תאים, דילול של צבעים חיוניים כגון carboxyfluorescein di-aetate succinimidyl אסתר (CFSE), חיסונית זיהוי של אנטיגנים mitogenic כגון ki67 או PCNA ו אנלוגים thymidine. אנלוגים Thymidine ניתן להבחין באמצעות מגוון שיטות לרבות זיהוי רדיו עבור thymidine tritiated, חיסונית לגילוי bromo-deoxyuridine (BrdU), כלורו-deoxyuridine (CldU) ו-iodo deoxyuridine (IdU), וזיהוי כימיים ethinyl-deoxyuridine (EDU). יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine שונים (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת לחוקרים לכמת במדויק שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. לפי פרוטוקולים immunostaining אופטימיזציה הגישה שלנו יכולה לזהות נמוך מאוד thymidine מנה אנלוגים מנוהל באמצעות מי השתייה, בטוח לנהל לעכברים לתקופות ממושכות של זמן. כתוצאה מכך, הטכניקה שלנו יכולה לשמש כדי לזהות תחלופת התאים ברקמות מאוד האריכה ימים. אופטימלית תוצאות מכתים immunofluoresent ניתן להשיג סוגי רקמות מרובות, כולל הלבלב, העור, המעי, הכבד, הכליות, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, מוח. יש לנו גם ליישם את הטכניקה הזו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות. יש לנו יותר ליישם את הטכניקה הזאת כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות. במובן זה, הממשל רציפים של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות.
Protocol
1. רקמות סימון CldU ו IdU
- ממיסים אנלוגים thymidine (CldU או IdU) במים. לשקול מ"ל 1mg / כימי כל ולהוסיף להפריד בקבוקי זכוכית של מים מזוקקים. אנחנו בדרך כלל להכין 1 ליטר של כל אחד בכל פעם.
- ממיסים את כימיקלים בצלחת ומערבבים או צורה אחרת של מסית. CldU תתמוסס בתוך 10 דקות. של תסיסה בטמפרטורת החדר. IdU דורש יותר משעה של תסיסה על 37 מעלות צלזיוס שייקר. מקורות המים יכולים להשפיע על מסיסות IdU. אם IdU נשאר השעייתה אחרי לילה רועד, נסה מקור שואב מים. הפתרונות מאוחסנים 4 ° C בחושך.
- ניהול הפתרון thymidine first המכיל (או CldU או IdU) כדי העכברים לתקופה תיוג הרצוי. אל תאפשר עכברים יש גישה למים ללא תווית בתקופת התווית. כאשר תקופת תיוג ייעודיים הושלמה, להתחיל סחף במים ללא תווית עבור 24 שעות לפחות (אנלוגים המכיל thymidine יש נסיוב וחצי חייהם של כמה שעות). ניהול הפתרון thymidine נוספת שהכילה (או CldU או IdU) כדי העכברים לתקופה תיוג הרצוי. מילוי בקבוקי מים באופן קבוע על מנת למנוע התייבשות!
- לחלופין, עכברים יכולים להיות מתויג בזריקה intraperitoneal רציפים של CdlU ואז IdU. הכן CldU או IdU בריכוז 10 מ"ג / מ"ל. IdU עשויים לדרוש ירידה מבחינת תוספת של פתרון נתרן הידרוקסיד מרוכז ואחריו רועד נמרץ להיכנס ההשעיה. אל תוסיף סודיום הידרוקסיד עודף. הוסף טיפה אחת של סודיום הידרוקסיד לפתרון 10 מ"ל של IdU ואחריו שעה של תסיסה על 37 מעלות צלזיוס שייקר. אם לא נמצא פתרון, חזור על תוספת של סודיום הידרוקסיד. הזרק 100mcg לכל גרם משקל הגוף לחלל intraperitoneal.
- שקופיות בקרה חיוניים פרוטוקול זה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים החוקרים לבצע כמה וריאציות של תיוג אנלוגי thymidine כדי להבטיח רגישות וספציפיות. אלה צריכים לכלול 1. עכברים תויגו רק עם CldU 2. עכברים תויגו רק עם IdU; 3. עכברים תויגו ברצף עם CldU ואז IdU; 4. עכברים תויגו ברצף בסדר הפוך, קודם עם IdU ואז CldU; 5 עכברים כי הם מדומה שכותרתו עם מים בלבד. כאשר לומדים תווית עם CldU ו IdU, החוקרים תמיד צריך לבצע את הפרוטוקול כולו עם כל 5 סטים של שקופיות מעל לשלוט מרקמות של עניין.
2. קציר רקמות, קיבעון, ו Slide הכנה
- באמצעות הרדמה המתאים, לבצע מנת יתר קטלנית ואז להקריב העכבר באמצעות exsanguination. הסרה של רקמה טרי לתקן עם paraformalehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העברת רקמות למאגר 01:04 חנות בפורמלין ב 4 ° C להטבעת.
- לחילופין, לבצע מנת יתר קטלנית אנקב את העכבר דרך החדר הלב נשאר עם תמיסת מלח עד דם מנוקה מן הגוף, ואז מיד perfuse עם 30-50 סמ"ק של paraformaldehyde 4%. הסר את הרקמות של עניין חנות מאגר 01:04 פורמלין על 4 מעלות צלזיוס להטבעת.
- לאחר התייבשות רקמה והטבעה פרפין, לחתוך 5 מיקרון סעיפים רקמות מקום על גבי שקופיות טעונה. אופים את השקופיות על 65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להבטיח הידבקות של רקמות להחליק (חיוני עם צעדים אנטיגן אחזור בהמשך).
3. , התייבשות Permeabilization ו Antigen Retrieval
- הסר פרפין עודף ידי טבילה שקופיות שתי אמבטיות קסילן במשך 5 דקות. כל אחד מהם.
- רעננותם הרקמה ידי טבילה שקופיות אתנול מדולל במים: 100, 95, 90, 80 70 ו 50%. משרים את השקופיות עבור 3 דקות. בריכוז אחד, החל 100% ו הולכת לקראת 50% לטבילה הסופי.
- לשטוף שקופיות עבור 5 דקות. ב 1x PBS.
- Permeabilize תאים ידי טבילה שקופיות פתרון Triton-X 0.2% במשך 5 דקות (עשה טריים בכל פעם).
- הכנת שקופיות לאחזור רקמות מיקרוגל אנטיגן. מניחים את השקופיות לתוך כוס זכוכית עם נפח מספיק 0.01M pH 6.0 סודיום ציטרט חיץ, כך שהפתרון מכסה 5 ס"מ מעל החלק העליון של השקופיות לתת דין וחשבון על אובדן אויר.
- מיקרוגל שקופיות עד הפתרון הוא רותחים (30-10 דקות. במלוא העוצמה). צמצום כוח עד לפתרון רותח לאט (10-80%) ולהמשיך 20 דקות נוספות. בדוק מיקרוגל מעת לעת כדי להבטיח את הפתרון נשאר לרתיחה איטית.
- כוס המקום המכיל שקופיות על גבי ספסל, ולאפשר בעדינות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, (כ 2 שעות).
- ודא שקופיות הם בטמפרטורת החדר באמצעות מדחום.
- מגלשות לטבול 1.5N HCL 40 דקות. בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שקופיות פעמיים 1X PBS, 5 דקות. לכל לשטוף.
4. יסודי ותיכון נוגדנים
- חשוב השקופיות להישאר לחה מאוד באמצעות פרוטוקול כולו. רקמה יבש יהיה אוטומטי הרבה יותרפלואורסצנציה, מה שהופך שהתקבל תמונות שמיש. כדי למנוע גוסס, שקופית אחת התהליך בכל פעם.
- כל סעיף מעגל בשקופיות עם נוזל חוסם (כלומר, שעווה) עט. מניחים את השקופיות לתוך מיכל של 1x PBS.
- הפוך תא הדגירה לח על ידי הנחת מגבות נייר רטוב מונח שטוח על החלק התחתון של מיכל פלסטיק אטום.
- להמציא פתרון חסימת בסרום חמור 10% בדילול מלא 1x PBS. חשוב לכסות כל חלק לחלוטין עם הפתרון. עבור חלקים כי הם רקמה 1 x 1.5 ס"מ, נפח של 50 מיקרו ליטר פתרון לכל סעיף מספיקה.
- מוסיפים את הפתרון חוסם את השקופיות. הסר שקופיות 1x PBS ולחסל נוזל עודף בעדינות על ידי הקשה על קצה להחליק על ערימה של מגבות נייר יבש. מקום להחליק בתא דגירה ולהוסיף 50 מיקרו ליטר פתרון לחסום 10% כל מקטע. כאשר כל השקופיות הושלמו לסגור את מיכל דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
- הכן דילול נוגדן ראשוני לאיתור IdU. מדולל עכבר אנטי BrdU בריכוז 1:250 ב חמור בדם 5% מתוצרת 1x PBS. הקש את פתרון לחסום משקופית ומקום בחזרה לתוך תא הדגירה. הוסף את הנוגדן הראשוני לעיל סעיף דגירה כל לילה בשעה 4 ° C.
- הכן לשטוף חומרה גבוהה (אשר ממזער מחייב ידי antisera אנטי BrdU העכבר כדי CldU). מאפרים TBST טרי נמוך חיץ מלח (36mM טריס, NaCl 50mm, 0.5% tween-20; pH 8.0). אתה צריך 40 מ"ל של חיץ לכל זוג של שקופיות. הוסף 40 מ"ל של חיץ צינור חרוטי 50 מ"ל כל אחד. לפני הוספת שקופיות, מחממים את הפתרון 37 ° C.
- שניים בכל פעם, להסיר שקופיות מתא הדגירה, למקם אותם גב אל גב (כך דגימות רקמה פנים רחוק אחד מהשני) ואת הברז נוגדן ראשוני עודף. מניחים את השקופיות הצינורות מלאים TBST מלח לכסות נמוך. להתסיס את הצינורות עבור 20 דקות. ב רועדת התרבות חיידקים באינקובטור עם הטמפרטורה ב 37 ° C, ואת המהירות מוגדר 225 סל"ד.
- שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף.
- הכן את הפתרון הבא נוגדן ראשוני לאיתור CldU ו אנטיגן רקמה, אם תרצה בכך. מדולל עכברוש אנטי BrdU בריכוז 1:250 ב חמור בדם 5% מתוצרת 1x PBS. מדולל antisera העיקרית נגד אנטיגן רקמה על עובד ריכוז לתוך הפתרון נוגדן ראשוני.
- הקש עודף 1x PBS את השקופיות, ולמקם אותם בתא דגירה. הוסף נוגדן ראשוני סעיף כל דגירה לילה בשעה 4 ° C.
- שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף.
- הכן את הפתרון נוגדנים משני. מדולל Cy2 חמור נגד חולדה כדי 1:250 ו Cy5 חמור נגד העכבר כדי 1:500 בתמיסה המכילה סרום 1X PBS חמור 5%. הוסף Cy3 משני לזהות מינים העיקרי של antisera אנטיגן רקמה. כמו כן, לדלל פתרון 0.4mg / mL המניות של DAPI עד 1:150 בתמיסה הנוגדן משנית.
- הקש עודף 1X שקופיות PBS את מקום בתא דגירה. הוסף פתרון נוגדנים משני כל מקטע ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- שטפו את השקופיות פעמיים ב טרי 1X PBS. 5 דקות. לכל לשטוף.
- הקש עודף 1X PBS את השקופיות לדבוק זכוכית מכסים להאריך זהב אנטי לדעוך התקשורת הרכבה (אל תשתמש Vectashield עם צבעים dyanine!). לחצו על תלושי לכסות כדי למנוע בועות אוויר. חנות ב 4 ° C.
5. דימות וניתוח
- תמונה רקמת עניין עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מקור אור אנרגיה גבוהה, תוכנית, apochromatic יעדים, יעילות גבוהה מיקרוסקופ המצלמה (למשל Hamamatsu אורקה ER). צלמו תמונות של AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (אנטיגן רקמות), ו Cy5 (IdU) ערוצים. מיזוג תמונות ליצור קובץ יחיד רב שכבתיים התמונה.
- אם מבוצעת כראוי, גרעינים DAPI מוכתם יהיה בהיר הומוגנית. אנטיגן רקמות (למשל אינסולין), צריך לחשוף תאים של עניין. אם מכתים עם DAPI או רקמות אנטיגן חלש או לא עקבי, שקופיות לטבול 1X PBS לילה להסיר את כיסוי לחמוק ולחזור על יישום antisera משנית.
- פוקוס על אנטיגן רקמה Cy3. בדוק CldU והכתים IdU ב Cy2 ו Cy5 ערוצים, החלפת בין ערוצים. חפש תגובתיות צולבת הפוטנציאל בין סמנים, כפי שצוין על ידי IdU מופרזת CldU שיתוף חיוביות. חפש רקמות שמכילות רק CldU או IdU. חוסר גרעינים או CldU IdU חיובי עשוי להצביע על בעיה טכנית עם תיוג או מכתים. במקרה זה, לחפש טישו replicative מאוד (למשל קשרי לימפה).
- ניתוח תמונות. הצגת שכבות המכילות DAPI ו אנטיגן רקמה. באמצעות סמן לוח לבן ביד הדומיננטית ודלפק תא ביד הלא דומיננטית, סמן כל גרעין עם סימן מנוגדים בטוש למחוק יבש (aka סמן לוח לבן). ספירת תאים DAPI חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא לספור תא מוחלט. השתמש במחק להסיר את סימני יובש. הצגת השכבהs המכיל DAPI, אנטיגן רקמות, CldU. ספירת תאים CldU חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא CldU לספור התא אך לא למחוק את הסימנים. שינוי התצוגה לדמיין שכבות המכיל אנטיגן רקמה, CldU ו IdU. הרוזן CldU IdU תאים חיובי כפול. ערך שיא, למחוק את כל הסימונים, ולהציג שכבות המכילות DAPI, אנטיגן רקמות, IdU. ספור את המספר הכולל של תאים IdU חיובי בתוך הרקמה של עניין. שיא IdU לספור התא.
6. נציג תוצאות
אנחנו ברצף שכותרתו 6 בן שבוע נקבות עכברים עם CldU למשך שבוע ולאחר מכן IdU במשך שבועיים, בעקבות הקרבה המיידית. Pancreata היו מוכתמים לזהות CldU, IdU, ו אינסולין (אנטיגן רקמה), כמו גם DAPI. איי היו מוכתמים אחיד עם אינסולין. גרעינים CldU היו מוכתמים נבדל גרעינים IdU צבעונית (איור 2). גרעינים רבים מחוץ איון היו CldU IdU שיתוף חיוביים (איור 2, ימין למטה, חצים לבנים). תא בודד אינסולין חיובי היה מכתים גרעיני הן CldU ו IdU (איור 2, ימין למטה, חץ מגנטה).
עכברים. ניסויים עם עכברים כל בוצעו על פי הנחיות ועדת IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה. נקבה B6.129 F1 wild-type עכברים נרכשו מ Taconic (Germantown ניו יורק), שוכנו במתקן חיה במעבדה בבית החולים לילדים של פילדלפיה, והאכילה עכבר דיאט 5015 מ PMI תזונה הבינלאומי (Richmond. אינדיאנה).
תיוג אסטרטגיה. על ידי סימון התא הראשון חלוקת האירוע CldU (מסומן ירוק בתכנית זו) ואת חלוקת התא השני עם IdU (מסומן באדום בתכנית זו), רציפים חלוקת התא תוצאות שיתוף שכותרתו תאים עם שני CldU ו IdU (ירוק / אדום) .
תוצאות נציג תיוג thymidine של מחזור התא בתוך הלבלב בעכברים. תמונה Immunofluorescent של הלבלב עכבר עם איון לנגרהנס במרכז. עכבר היה רווי CldU שבוע 1 ואז IdU 2 שבועות במי השתייה לפני להקריב מיידית. מדגם לבלב היה מעובד כמתואר בפרוטוקול. תמונות אובייקטיבי 40X, עם שכבות נפרדות מוצגת מתאים לספור. תמונות שמוזגו מכילים DAPI (לבן) CldU (ירוק), IdU (אדום), אינסולין (צהוב). (העליון משמאל) DAPI ואינסולין. (העליונה, מימין) CldU ואינסולין. (נמוך, משמאל) IdU ואינסולין. (נמוך, מימין) CldU, IdU, ו אינסולין. בר סולם: 100μm.
באיור 1. אסטרטגיה תיוג. על ידי סימון התא הראשון חלוקת האירוע CldU (מסומן ירוק בתכנית זו) ואת חלוקת התא השני עם IdU (מסומן באדום בתכנית זו), רציפים חלוקת התא תוצאות שיתוף שכותרתו תאים עם שני CldU ו IdU (ירוק / אדום) .
איור 2. תוצאות נציג תיוג thymidine של מחזור התא בתוך הלבלב בעכברים. תמונה Immunofluorescent של הלבלב עכבר עם איון לנגרהנס במרכז. עכבר היה רווי CldU שבוע 1 ואז IdU 2 שבועות במי השתייה לפני להקריב מיידית. מדגם לבלב היה מעובד כמתואר בפרוטוקול. תמונות אובייקטיבי 40X, עם שכבות נפרדות מוצגת מתאים לספור. תמונות שמוזגו מכילים DAPI (לבן) CldU (ירוק), IdU (אדום), אינסולין (צהוב). (העליון משמאל) DAPI ואינסולין. (העליונה, מימין) CldU ואינסולין. (נמוך, משמאל) IdU ואינסולין. (נמוך, מימין) CldU, IdU, ו אינסולין. בר סולם: 100μm.
Discussion
הגישה שלנו להתקרב thymidine מבוסס תיוג מחזור התא יש יישומים פוטנציאליים רבים במחקר ביו. עד כה, אנחנו מתרכזים בלבלב, אבל יש לנו גם ליישם אסטרטגיה זו לבחון תחלופת התאים של העור, המעי, הכבד, הכליות הכליה, אשך, שחלות, בלוטת התריס, בלוטת לימפה, hematopoiesis, המוח 1. בגלל תחלופת התאים נע בין רקמה לרקמה, אסטרטגיות תיוג צריך להיות מותאם אישית כדי להשיג את המידע משכנעת ביותר מאיבר של עניין. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 לכל תווית hematopoiesis 2. קון ועמיתיו להשתמש CldU ו IdU במשך 4 ימים כל לזהות חלוקת התא התחדשות שריר הלב 3. לעומת זאת, השתמשנו CldU ו IdU עד 9 חודשים סך תווית מחזור התאים הבזליים בתוך איים הלבלב, רקמה עם מחזור התא מינימלי כפי הגילאים חיה 1,4-6. יישום הפוטנציאל הברור ביותר של האסטרטגיה שלנו היא תיוג ללימודי להגדיר את תחלופת התאים בתוך רקמת הומאוסטזיס. אבל הטכניקה שלנו יש מספר יישומים פוטנציאליים אחרים. למשל, יש לנו גם להחיל לאחרונה בטכניקה זו כדי לזהות שינוי בשעור בתוך רקמות, שם מהמוקדים של שכפול מוגברת ניתן לזהות בקלות על ידי שילוב מוגבר של CldU או IdU 5. מוריסון ועמיתיו השתמשו CldU ו IdU ליום 1 כל לבדיקת התנהגות תווית שמירה של בתאי גזע hematopoietic 2. יש לנו גם להחיל thymidine רציפים אנלוגי תיוג כדי לקבוע אם המעבר, הגברה תאים לתרום לצמיחה או התחדשות של רקמות 1. בשנת הממשל יישום רציף של אנלוגים thymidine מייצג גישה חדשנית לחקר מקורותיו ואת ההישרדות של תאים מעורבים הומאוסטזיס רקמות.
אנלוגים Thymidine לא אמור לשמש ללא זהירות. אנלוגים סינתטיים thymidine יש פוטנציאל רעילות לתאי חלוקה, והשימוש בהן יכול תיאורטית לפגוע תחלופת התאים בבעלי חיים גוברת. אנלוגים Thymidine שימשו סוכני radiosensitizing למען ילדים חולי סרטן, ועלול להאט מחזור התא. לפיכך אנו קוראים לחוקרים לחקור בזהירות על פוטנציאל רעילות ברקמות העניין שלהם. לדוגמה, Trumpp ועמיתיו לגלות כי BrdU מערכתית יכול להכריח בתאי גזע hematopoietic להיכנס מחזור התא 7. למשל, ראטר ועמיתיו גילו כי מינון גבוה thymidine אנלוגים רעילים בפיתוח לבלב 8. לאחרונה Hellerstein ועמיתיו KineMed, Inc מצאו כי BrdU הממשל מאט תוך איון שגשוג על ידי 16-25% באמצעות תיוג קניינית כבד מים טכניקה 9. ההכנות איון שלם בשימוש על ידי Hellerstein ועמיתיו הכלול האנדוקרינית רבים אחרים סוגי תאים אנדוקריני שאינם, אשר יכול לכלול עד 50% ההכנות איון מוחלט. עם זאת, אנו מוצאים כי אינפוזיה ממושכת של BrdU אינו משפיע על בטא התפשטות תאים בעכברים בוגרים צעירים, כפי שהיא נמדדת על ידי ביטוי ki67 4. כמו כן, בטווח הארוך הממשל של CldU ו IdU לא נראה לפגום תא בטא המוני הרחבה 1. יתר על כן, בטא ריבוי שיעורי סלולריים הם המקבילה בין עכברים שכותרתו עם BrdU עבור תקופות זמן ארוכות ועכברים מסומנים רק לכמה שעות (שיעורי מנורמל לתקופות זמן שווה ערך). יחד, משתמע מתוצאות אלה כי עכברים יכולים לסבול בבטחה לטווח ארוך במינון נמוך הממשל של אנלוגים thymidine. ובכל זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את פוטנציאל הרעילות של אנלוגים thymidine בצמיחה בטא בלבלב התא. כתוצאה מכך, אנו ממשיכים לבצע בקרות כאשר תיוג עכברים עם אנלוגים thymidine, והדחף חוקרים אחרים לעשות זאת גם כן.
הטכניקה שלנו של תיוג thymidine רציפים אנלוגי הוא לא בלי pitfalls ואתגרים טכניים. כתוצאה מכך, שקופיות בקרה חשובים במיוחד. יש לנו שנוצר שקופיות בקרה מורכב של רקמות שונות 1) עכברים תויגו רק עם CldU:.. 2) עכברים תויגו רק עם IdU;. 3) עכברים תויגו ברצף עם CldU ואז IdU;. 4) עכברים תויגו ברצף בסדר הפוך, קודם עם IdU ואז CldU;. 5) עכברים כי הם מדומה שכותרתו עם מים בלבד. כאשר לומדים תווית עם CldU ו IdU, החוקרים תמיד צריך לבצע את הפרוטוקול כולו עם כל 5 סטים של שקופיות מעל מרקמות של עניין.
תגובתיות בין קלה בין CldU ו IdU הוא החיסרון מצער אך בלתי נמנעים תיוג עם שני אנלוגים thymidine. הטכניקה CldU ו IdU מבוסס על ההבדלים זיקות בין antisera כי הופקו במקור מינים שונים (עכבר וחולדה) נגד BrdU. פרוטוקול שלנו, בעוד מסורבלת, נועד למזער את תגובתיות לחצות כזה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים על זהירות בקרב חוקרים הרואים דילוג שלב (ים) של פרוטוקול. בפרט, יש לנונתקלו בבעיות עם antisera משנית כי הם תגובתי לעבור בין עכבר וחולדה. זה יכול להיות ממוזער על ידי שימוש antisera ג'קסון כי הם מלא צולבות adsorbed בין עכבר וחולדה.
מדי פעם אנו מצליחים לזהות כראוי ההתאגדות thymidine. במקרים כאלה הוא קריטי חשוב להשתמש בשקופיות בקרה חיובית כדי לקבוע איזה מגיב או צעד לא עבד. קשיים בדרך כלל עקב aliquots רע של antisera, מגלשות יבשות, או permeabilization גרעיני לקוי. נכשלנו בהצלחה תווית בפיתוח עוברים עם IdU. לפיכך, לא כל רקמות עשויה להיות חדיר IdU.
חלופות CldU ו IdU תיוג thymidine כפול אנלוגי הם באופק. EDU (5-ethinyl deoxyuridine-2) יכול להיות המצע של catalyzed זיהוי נחושת כימיה לחץ 10,11. שיטות זיהוי Edu אינם דורשים הפרדת גדילי דנ"א, ולפיכך הם נוחים מאוד לניתוח על ידי 12 cytometry הזרימה. Edu תואם, אך לא לחצות תגובתי עם BrdU 10. Edu שימש לכמת תחלופת התאים של רקמות שונות, כולל עכבר לתאי בטא בלבלב 13, בתאי המעי L 14 ו - 15 אפידרמיס. Edu יקר למדי כרגע ($ 1000 בארה"ב לכל 500 מ"ג). עם זאת, זיהוי Edu נראה הרבה יותר רגישים מאשר BrdU זיהוי 10. לכן, זה יכול להיות מבחינה כלכלית לשלב Edu ו BrdU במקום CldU ו IdU. שיטה זו עשויה גם לאפשר זיהוי של שלושה סיבובים שונים של חלוקת התא בעכברים שכותרתו פי שלוש עבור edu, CldU ו IdU.
לסיכום, הטכניקה שלנו תיוג thymidine רציפים אנלוגי היא גישה חדשנית לגילוי מחזור התא. אנו מקווים הגישה שלנו מאפשרת למדענים אחרים כדי לכמת בצורה מדויקת יותר חלוקת התא, ואנו מצפים שזה יהיה פתוח פרדיגמות חדשות הומאוסטזיס רקמות.
Disclosures
ניסויים עם עכברים כל בוצעו במתקן חיה בבית החולים לילדים של פילדלפיה על פי ההנחיות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).
Acknowledgments
נתמכים על ידי JDRF, ה-NIH (R01-DK081469), העמים של פנסילבניה (המרכז למצוינות הרגנרציה לרפואה מענק 4100043362), מצעד הפרוטות (בזיל אוקונור האשכול פרס מחקר מלומד), וכן אוניברסיטת פנסילבניה טייס DERC היתכנות מענק (DK19525).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 0210547891 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | MP Biomedicals | 0210035701 | |
| 4% Paraformaldehyde | USB Corp., Affymetrix | 19943 | |
| 10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| XYLENES | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS, 10X Powder Concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Triton –X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Hydrochloric Acid | VWR international | BDH3028-2.5LG | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Mouse Anti BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Rat mab anti BrdU | Accurate Chemical & Scientific Corporation | OBT0030 | |
| Cy2 donkey anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 712-225-153 | Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity). |
| Cy5 donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | See above |
| Glass Cover Slips | Sigma-Aldrich | C9056-1CS | |
| YFP Filter | Chroma Technology Corp. | 49003 ET EYFP | Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel |
| Cy3 Filter | Chroma Technology Corp. | 49004 ET Cy3 | |
| Cy5 Filter | Chroma Technology Corp. | 49006 ET Cy5 | |
| ORCA ER Microscope Camera | Hamamatsu Corp. | C4742-95-12ER | Excellent detection of fluorophores |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes). |
References
- Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).
- Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).
- Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
- Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. , (2009).
- He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. , (2009).
- Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).
- Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).
- Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).
- Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).
- Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).
- Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).
- Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).
- Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).
- Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).
- Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).
- Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).
