Il verme nematode intensamente studiato<em> Caenorhabditis elegans</em> Può essere transgenically progettato per esprimere l'umano peptide β-amiloide (Aβ). Espressione indotta di Aβ in<em> C. elegans</emMuscolare> porta ad un rapido, fenotipo paralisi riproducibile che può essere utilizzato per monitorare i trattamenti che modulano la tossicità Aβ.
Accumulo del peptide β-amiloide (Aβ) è generalmente ritenuto centrale per l'induzione della malattia di Alzheimer, ma il meccanismo in questione (s) di tossicità sono ancora poco chiari. Aβ è depositato per via intramuscolare nella miosite inclusione dell'organo, un grave miopatia umano. Il intensamente studiato verme nematode Caenorhabditis elegans può essere transgenically progettato per esprimere Aβ umano. A seconda del tessuto o la tempistica di espressione Aβ, vermi transgenici possono avere fenotipi facilmente misurabili che servono come lettura di tossicità Aβ. Per esempio, vermi transgenici con pan-neuronale espressione Aβ avere difetti è l'apprendimento associativo (Dosanjh et al 2009.), Mentre i vermi transgenici con costitutiva muscolo-specifica espressione mostrano un progressivo, età-dipendente fenotipo paralisi (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particolarmente utile C. elegans modello si avvale di un sensibile alla temperatura mutazione del sistema di sorveglianza di mRNA ingegnere temperatura-inducibile espressione muscolare di un transgene Aβ, con conseguente paralisi fenotipo riproducibile su cambio marcia temperatura (Link et al. 2003). Trattamenti che contrastare la tossicità Aβ in questo modello [per esempio, espressione di un transgene di protezione (Hassan et al. 2009) o l'esposizione a estratti di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] riproducibile alterare il tasso di paralisi indotta dalla temperatura salire di marcia di questi transgenici vermi. Qui si descrive il nostro protocollo per misurare il tasso di paralisi in questo C. transgenico elegans modello, con particolare attenzione alle variabili sperimentali che possono influenzare questa misura.
Il protocollo che abbiamo descritto può essere efficacemente utilizzato per test gli effetti dei composti sulla tossicità Aβ. Esempi pubblicati includono gli effetti costituenti dell'estratto di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Composti che sono stati protettivo contro la tossicità Aβ in altri sistemi hanno anche dimostrato di essere protettivo in questo modello (ad esempio, la memantina, i nostri risultati non pubblicati). Una logica importante per stabilire questo modello è che gli strumenti genetici e molecolari ben sviluppato in C. elegans può essere usato per indagare i meccanismi di tossicità Aβ. Quindi, le mutazioni effetti specifici sulla tossicità Aβ può essere analizzati (ad esempio, l'effetto di ridurre insulino-simile di segnalazione introducendo un daf-2 perdita di funzione di mutazione, Florez-McClure et al. 2007), e questo modello può anche essere usato per esaminare gli effetti di sovra-espressione transgeni (Fonte et al. 2008). Di recente abbiamo fatto ampio uso di questo modello per esaminare gli effetti sulla tossicità di singole sostituzioni aminoacidiche nella Aβ (dati non pubblicati).
Il modello transgenico qui descritto analisi l'effetto di acuta espressione Aβ sulla funzione delle cellule muscolari. Al tempo delle cellule muscolari e paralisi loro sarcomero sono intatte, il fenotipo paralisi non è il risultato della morte delle cellule muscolari. Tuttavia, dopo la paralisi (~ 48 ore dopo il cambio marcia iniziale) vi è una ripartizione di integrità muscolare e la morte dei vermi. Non abbiamo studiato questo effetto a valle di espressione Aβ o utilizzati come marker di tossicità.
La Aβ modello inducibile espressione qui descritto non è appropriato per indagare trattamenti che modulano β-amiloide formazione di per sé. Anche se i vermi transgenici con la forma costitutiva espressione Aβ depositi di amiloide facilmente rilevabili (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), vermi transgenici con espressione inducibile Aβ raramente hanno depositi di amiloide e il fenotipo paralisi appare indipendente dalla deposizione di amiloide (Drake et al. 2003). I nostri risultati sono coerenti con la visione che la tossicità acuta dei risultati indotta da Aβ espressione l'accumulo di Aβ solubile oligomerici, non deposizione di amiloide.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare i membri attuali e precedenti del laboratorio link che ha contribuito a sviluppare i protocolli descritti qui, in particolare Gin Fonte, che ha sviluppato il procedimento originale. Questo lavoro è stato supportato da riconoscimenti dal NIH (AG12423) e l'Alzheimer Association (Premio Zenith) alla Cdl
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |