Den intensivt studerade rundmasken masken<em> Caenorhabditis elegans</em> Kan transgenically konstruerad för att uttrycka mänskliga β-amyloid peptid (A-beta). Inducerad uttryck av A-beta i<em> C. elegans</em> Muskulatur leder till en snabb, reproducerbar förlamning fenotyp som kan användas för att övervaka behandlingar som modulerar A-beta-toxicitet.
Ackumulering av β-amyloid peptid (A-beta) är i allmänhet tros vara central för induktion av Alzheimers sjukdom, men den relevanta mekanism (er) på toxicitet är fortfarande oklart. A-beta är också deponeras intramuskulärt i Inclusion Body Myosit, en svår människa myopati. Den intensivt studerade rundmasken masken Caenorhabditis elegans kan transgenically konstruerad för att uttrycka mänskliga A-beta. Beroende på vilken vävnad eller tidpunkten för A-beta-uttryck kan transgena maskarna ha lätta att mäta fenotyper som fungerar som en avläsning av A-beta-toxicitet. Till exempel, transgena maskarna med pan-neuronala A-beta-uttrycket har fel är associativ inlärning (Dosanjh et al 2009.) Medan transgena maskarna med konstitutiva muskel-specifikt uttryck visar en progressiv, åldersberoende förlamning fenotyp (Länk, 1995; Cohen et al . 2006). Ett särskilt användbart C. elegans modell använder ett temperaturkänsligt mutation i mRNA övervakningssystem till ingenjör temperatur-inducerbara muskel uttryck för en A-beta-transgen, vilket resulterar i ett reproducerbart förlamning fenotyp på temperatur uppväxling (Link et al. 2003). Behandlingar som motverkar A-beta-toxicitet i denna modell [t.ex. uttryck för en skyddande transgen (Hassan et al. 2009) eller exponering för Ginkgo biloba extrakt (Wu et al. 2006)] reproducerbart ändra satsen av förlamning orsakas av temperatur uppväxling av dessa transgena maskar. Här beskriver vi våra protokoll för att mäta graden av förlamning i den här transgena C. elegans modell, med särskild tonvikt på experimentella variabler som kan påverka detta mått.
Protokollet har vi beskrivit effektivt kan användas för analys av effekterna av föreningar på A-beta-toxicitet. Publicerad exempel är effekterna av Ginkgo biloba extrakt beståndsdelar (Wu et al. 2006) och reserpin (Arya et al. 2009). Substanser som har skydd mot A-beta-toxicitet i andra system har också visat sig vara skyddande i denna modell (t.ex. memantin, vår opublicerade resultat). Ett viktigt motiv för att upprätta denna modell är att den väl utvecklade genetiska och molekylära verktyg som finns i C. elegans kan användas för att undersöka mekanismerna bakom A-beta-toxicitet. Därmed kan effekterna specifika mutationer på A-beta-toxicitet analyseras (t ex leder till minskad insulin-liknande signalering genom att införa en DAF-2 bortfall av funktion mutation Florez-McClure et al. 2007), och denna modell kan också användas för att undersöka effekterna av över-uttryck transgener (Fonte et al. 2008). Vi har nyligen gjort omfattande användning av denna modell för att undersöka effekterna på toxicitet enda aminosyrasubstitutioner i A-beta (opublicerade data).
De transgena modell som beskrivs här analyser effekten av akut A-beta uttryck muskelcell funktion. Vid tidpunkten för cellerna förlamning muskler och deras sarcomere är intakta, den förlamning fenotyp är inte ett resultat av muskel celldöd. Men efter förlamning (~ 48 h efter inledande uppväxling) finns en uppdelning av muskel integritet och slutligen död av maskar. Vi har inte undersökt detta nedströms effekt av A-beta-uttryck, eller använt det som ett toxicitet markör.
Den inducerbara A-beta-uttrycket modell som beskrivs här är inte lämplig för att undersöka behandlingar som modulerar β-amyloid bildas i sig. Även om transgena maskarna med konstitutivt A-beta uttrycksform lätt kan upptäckas amyloid insättningar (Fay et al 1998,.. Link et al 2001), transgena maskarna med inducerbara A-beta-uttrycket har sällan amyloid insättningar och förlamning fenotyp verkar oberoende av amyloid nedfall (Drake et al. 2003). Våra resultat överensstämmer med uppfattningen att akuta giftighet inducerad resultat A-beta-uttryck från ansamling av lösliga oligomeric A-beta, inte amyloid nedfall.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka nuvarande och tidigare medlemmar av Link labbet som hjälpt till att utveckla de protokoll som beskrivs här, framför allt Gin Fonte, som utvecklade det ursprungliga förfarandet. Detta arbete har stötts av utmärkelser från NIH (AG12423) och Alzheimers Association (Zenith Award) till CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |