התולעת נמטודות למד באינטנסיביות<em> Caenorhabditis elegans</em> יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב<em> ג elegans</emשריר> מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.
הצטברות של הפפטיד β עמילואיד (Aβ) הוא האמין בדרך כלל להיות מרכזי הגיוס של מחלת אלצהיימר, אך המנגנון הרלוונטי (ים) של רעילות עדיין אינם ברורים. Aβ מופקד גם לתוך שריר ב שררת הכללה גוף, מיופתיה אדם חמורה. תולעת למד באינטנסיביות נמטודות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically להביע Aβ האדם. בהתאם הרקמה או העיתוי של הביטוי Aβ, תולעים מהונדס יכול לקבל פנוטיפים מדידים בקלות המשמשים לקריאה מתוך רעילות Aβ. לדוגמה, תולעים מהונדס עם הביטוי הפאן העצבית Aβ יש פגמים היא למידה אסוציאטיבית (Dosanjh et al 2009.), בעוד תולעים מהונדס במבט המכונן שריר ספציפי להראות תלויי גיל מתקדם, שיתוק הפנוטיפ (קישור, 1995; כהן ואח' . 2006). אחת שימושית במיוחד C. elegans מודל מעסיקה מוטציה טמפרטורה רגיש במערכת מעקב mRNA מהנדס טמפרטורה ועין מתנהלת הביטוי שריר transgene Aβ, וכתוצאה מכך פנוטיפ שיתוק לשחזור על upshift טמפרטורה (Link et al. 2003). טיפולים נגד רעילות Aβ במודל זה [למשל, הביטוי של transgene מגן (חסן et al. 2009) או חשיפה תמציות גינקו בילובה (וו et al. 2006)] reproducibly לשנות את שיעור שיתוק הנגרם על ידי upshift הטמפרטורה של אלה מהונדס תולעים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שלנו למדידת שיעור השיתוק הזה ג מהונדס דגם אלגנס, עם תשומת לב מיוחדת משתנים ניסיוניים, כי זה יכול להשפיע על המדידה.
פרוטוקול שתיארנו ניתן להשתמש ביעילות כדי assay את ההשפעות הרעילות של תרכובות על Aβ. פורסם דוגמאות כוללות את השפעת גינקו בילובה תמצית המרכיבים (וו et al. 2006) ו – רסרפין (אריה et al. 2009). תרכובות כי כבר מגן מפני רעילות Aβ במערכות אחרות יש גם הוכח להיות מגן במודל זה (למשל, ממנטין, התוצאות שלנו לא פורסם). הרציונל חשוב להקמת מודל זה היא כי מפותח כלים גנטיים ומולקולריים זמין ב C. elegans יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים של רעילות Aβ. לפיכך, השפעת מוטציות ספציפיות על רעילות Aβ ניתן assayed (למשל, את ההשפעה של הפחתת דמוי אינסולין איתות על ידי החדרת daf-2-הפסד של פונקציית מוטציה, Florez-מקלור et al. 2007), המודל הזה יכול גם ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות של מעל ביטוי transgenes (פונטה et al. 2008). עשינו לאחרונה שימוש נרחב במודל זה כדי לבחון את ההשפעות על הרעילות של יחיד החלפות חומצות אמינו Aβ (נתונים שלא פורסמו).
המודל המתואר כאן מהונדס מבחני ההשפעה של הביטוי Aβ חריפה על תפקוד תא שריר. בזמנו של שריר תאים שיתוק sarcomere שלהם הם שלמים; את הפנוטיפ שיתוק אינו תוצאה של מוות של תאים בשריר. עם זאת, לאחר שיתוק (~ 48 שעות לאחר upshift הראשונית) יש פירוט של שלמות השריר ועל המוות הסופי של התולעים. אנחנו לא בחנו את האפקט הזה במורד הביטוי Aβ או השתמשו בו כסמן רעילות.
Aβ ועין מתנהלת ביטוי המודל המתואר כאן אינו מתאים חוקרת טיפולים לווסת β עמילואיד היווצרות כשלעצמה. למרות תולעים מהונדס עם טופס ביטוי מכוננת Aβ פיקדונות עמילואיד לזיהוי בקלות (פיי et al 1998;.. Link et al 2001), תולעים מהונדס עם הביטוי Aβ ועין מתנהלת לעתים נדירות יש מרבצי העמילואיד ואת הפנוטיפ מופיע שיתוק עצמאית של בתצהיר עמילואיד (דרייק et al. 2003). תוצאות המחקר עולות בקנה אחד עם הדעה כי רעילות חריפה הנגרמת ביטוי בתוצאות Aβ מהצטברות של Aβ oligomeric מסיסים, לא בתצהיר עמילואיד.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לחברי בהווה ובעבר המעבדה קישור שעזר לפתח את פרוטוקולי המתואר כאן, במיוחד ג'ין פונטה, אשר פיתח את ההליך המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (AG12423) ואת איגוד האלצהיימר (פרס זניט) כדי CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |