Интенсивно изучал нематод червь<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческий β-амилоида пептида (Ар). Индуцированная экспрессия в Ар<em> С. Элеганс</em> Мышц приводит к быстрому, воспроизводимые фенотип паралич, который может использоваться для мониторинга лечения, которые модулируют Ар токсичности.
Накопление β-амилоида пептида (Ар), как правило, считается, что центральное место в индукции болезни Альцгеймера, но и соответствующий механизм (ы) токсичности по-прежнему неясны. Ар также хранение внутримышечно Включение миозит, миопатия тяжелой человека. Интенсивно изучал нематод Caenorhabditis Элеганс червя может быть transgenically спроектирован, чтобы выразить человеческие Ар. В зависимости от ткани или сроки Ар выражение, трансгенные червей может быть легко измеримы фенотипы, которые служат для чтения из Ар токсичности. Например, трансгенные червей с пан-нейронов Ар выражения имеют дефекты ассоциативно обучения (Dosanjh и др. 2009 год.), А трансгенные червей с учредительными мышц конкретное выражение показать прогрессивный, возраст-зависимых фенотип паралич (Link, 1995; Коэн и др. . 2006). Одним из наиболее полезных C. Элеганс модель использует чувствительные к температуре мутации в системе наблюдения мРНК для инженера температуры индуцибельной мышц выражение Ар трансгенов, в результате чего воспроизводимый фенотип паралич от температуры повышающую передачи (Link и соавт. 2003). Методы лечения, которые счетчик Ар токсичности в этой модели [например, выражение защитные трансгенов (Хасан и соавт. 2009) или воздействия экстракта гинкго билоба (Wu и соавт. 2006)] воспроизводимо изменять скорость паралич индуцированных температурой повышающую передачи этих трансгенных червей. Здесь мы описываем наш протокол для измерения скорости паралич в этой трансгенных C. Элеганс модели, обращая особое внимание на экспериментальных переменных, которые могут повлиять на это измерение.
Протокол мы описали могут быть эффективно использованы для анализа эффектов соединений на Ар токсичности. Опубликованные примеры включают эффекты Гинкго билоба трехсторонним (Wu и соавт. 2006) и резерпин (Арья и соавт. 2009). Соединения, которые были защитными против Ар токсичности в других системах, также было показано, что защитное в этой модели (например, мемантин, наши неопубликованные результаты). Важным обоснованием для создания этой модели является то, что хорошо развитая генетические и молекулярные инструменты, доступные в C. Элеганс могут быть использованы для исследования механизмов Ар токсичности. Таким образом, эффекты специфических мутаций на Ар токсичности могут быть проанализированы (например, эффект снижения инсулиноподобный сигнализации путем введения DAF-2 с потерей функции мутации, Флорес-МакКлюр и соавт. 2007), и эта модель также может быть использована для изучения влияния на выражение трансгены (Фонте и соавт. 2008). В последнее время мы широко использовали эту модель для изучения воздействия на токсичность одного аминокислотных замен в Ар (неопубликованные данные).
Трансгенные модели, описанной здесь анализы эффект острого Ар выражение мышечной функции клетки. Во время паралича мышечных клеток и их саркомера не повреждены; паралич фенотип не является результатом мышечного гибели клеток. Однако, после паралича (~ 48 часов после первоначального повышающую передачи) существует распад целостности мышц и возможной гибели червей. Мы не исследовали этот эффект ниже по течению от Ар выражение или использовали его в качестве маркера токсичности.
Выражение индуцибельной Ар модели, описанной здесь не подходит для исследования лечения, которые модулируют β-амилоида образованию как таковому. Хотя трансгенные червей с учредительными форма выражения Ар легко обнаружить отложения амилоида (Фэй и др., 1998;.. Ссылка и др. 2001), трансгенные червей с индуцибельной выражение Ар редко амилоидных отложений и паралич фенотип появляется независимо от амилоида (Drake и соавт. 2003). Наши результаты согласуются с мнением, что острая токсичность индуцированных Ар выражение результатов накопления растворимых олигомерных Ар, не амилоидных отложений.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить действующих и бывших членов ссылка лабораторию который участвовал в разработке протоколов, описанных здесь, в частности, Джин Фонте, который разработал оригинальную процедуру. Эта работа была поддержана награды от НИЗ (AG12423) и Ассоциации Альцгеймера (Zenith Award) в CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |