التقاط المركبات هي عبارة عن جزيئات صغيرة trifunctional للحد من تعقيد بروتيوم الوظيفية التي عكسها التفاعل جزيء بروتين صغير يليه يشابك – الصور وتنقيتها. نستخدم هنا لقطة مع مجمع<em> S</em> – adenosyl -<sub> L</sub> – الهموسيستين ملزم وظيفة انتقائية لعزل من methyltransferases<em> القولونية</em> خلية كاملة lysate والتعرف عليهم بواسطة MS.
هناك مجموعة متنوعة من النهج للحد من تعقيد بروتيوم على أساس وظيفي التفاعلات جزيء صغير من البروتين مثل اللوني تقارب 1 أو التنميط نشاط البروتين واستنادا 2. التقاط المركبات Trifunctional (CCS ، الشكل 1A) 3 هي أساس لنهج عام ، والتي يحركها التوازن الأولي بين تحقيق التفاعل جزيء صغير (وظيفة انتقائية ، وهنا S – adenosyl – L – الهموسيستين ، SAH ، الشكل 1A) ويتم إصلاح البروتينات الهدف بشكل لا رجعة فيه على الصورة ، يشابك بين وظيفة مستقلة التفاعل الصور activable (هنا phenylazide) من القانون الجنائي والسطح من البروتينات الهدف. وظيفة الفرز (هنا البيوتين) يعمل على عزل CC — تقارن البروتين من الخلائط البيولوجية المعقدة مع مساعدة من المرحلة الصلبة (هنا الخرز streptavidin المغناطيسي). طرازين من التجارب ممكنة : "بعيدا عن حبة" (4) أو وصف في الوقت الحاضر "على حبة" التكوين (الشكل 1B). قد تكون انتقائية وظيفة تقريبا أي جزيء صغير من الفائدة (ركائز ، ومثبطات ، جزيئات المخدرات).
S – Adenosyl – L – ميثيونين (SAM ، الشكل 1A) هو على الارجح ، والثانية للبطولة ، والعامل المساعد الأكثر استخداما على نطاق واسع في الطبيعة 5 ، 6. فهو يستخدم بوصفه المانح الميثيل المجموعات الرئيسية في جميع الكائنات الحية مع كونها المحفز التفاعل الكيميائي بواسطة SAM – تعتمد methyltransferases (MTases) ، الذي ميثيلات DNA 7 ، 8 الحمض النووي الريبي والبروتينات 9 أو 10 جزيئات صغيرة. نظرا للدور الحاسم من ردود الفعل الفيزيولوجية مثيلة في سيناريوهات متنوعة (الجينات التنظيم ، علم التخلق ، والتمثيل الغذائي) ، ويمكن أن يتوقع من التنميط للMTases لتصبح ذات أهمية مماثلة في البروتيوميات الوظيفية مثل التنميط من الكينازات. الأدوات التحليلية لالتنميط بهم ، ومع ذلك ، لم تكن متوفرة. قدمنا مؤخرا مع CC SAH كمجموعة الانتقائية لملء هذه الفجوة التكنولوجية (الشكل 1A).
SAH ، نتاج SAM بعد نقل الميثيل ، وهو منتج معروف MTase العامة المانع 11. لهذا السبب ، وأنه يتم استخدام العامل المساعد الطبيعية SAM بواسطة انزيمات نقل مزيد من أجزاء أخرى من العامل المساعد أو الشروع في ردود الفعل المتطرفة وكذلك بسبب عدم الاستقرار الكيميائي 12 ، SAH الانتقائية هي وظيفة مثالية لCC لاستهداف MTases. هنا ، نحن تقرير فائدة SAH – CC والتي CCMS MTases التنميط وغيرها من البروتينات SAH ملزم من DH5α سلالة من القولونية (اي كولي) ، واحدة من أفضل تتميز بدائيات النوى ، والتي كانت بمثابة النموذج المفضل الكائن في عدد لا يحصى من الدراسات البيوكيميائية والبيولوجية والبيوتكنولوجية. الصورة تنشيط يشابك تزيد الغلة وحساسية هذه التجربة ، ويمكن بسهولة خصوصية اختبار للمنافسة في التجارب باستخدام فائض من SAH الحرة.
قد الاحتياطات التالية والتعليقات تكون مفيدة عند بعد بروتوكول وصف : أ) والميزة الرئيسية لبطاقات الإئتمان يكمن في تشكيل الرابطة التساهمية بين CC وMTase ، حسب هذا يسمح لاحقة الشروط غسل صرامة. يتحقق تشعبي التساهمية بواسطة نجم عن تفاعل ضوئي ضوء الأشعة فوق البنفسجية (310 نانومتر كحد أقصى). ضوء النفقات العامة العادية يحتوي فقط على جزء صغير من الأشعة فوق البنفسجية ، ولكن ، وحماية SAH – CC أطول من التعرض لأشعة الشمس أو الحمل حتى يصل إلى تشعيع للرقابة وتبريده في caproBox. ب) من العينات البيولوجية التي MTases أن تكون معزولة قد تحتوي على البروتينات عرضة لتمسخ ، وبالتالي فمن الإلزامي للحفاظ على عينات باردة وتجنب مزبد في جميع الأوقات. ج) caproBox يبرد العينات الى 0-4 درجة مئوية ، والمصابيح التي ينبعث منها ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، ولكن ، كما تنبعث منها الحرارة. لذا فمن الضروري أن أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة قبل ان القنينات التشعيع ، لذلك البروتينات التمسك القبعات أو جدران لا يمكن شكل قارورة بذور هطول الأمطار. د) وإذا أعيد تعليق الخرز المغناطيسية (على سبيل المثال في الحلول يغسل) غير ممكن من جهة ، وتطبيق فترة وجيزة فوق الصوتية عن طريق وضع العينات في حمام بالموجات فوق الصوتية. ه) إعداد فرشلي 0.2 ٪ في حل ACN TFA/60 ٪. وجدنا أن ذلك قد لا يكون القبض على البروتينات المشقوق من الخرز. و) ويتم التحليل النهائي للبروتينات استولت بها LC-MS/MS. الطيف الكتلي هو طريقة حساسة للغاية. فمن الضروري استخدام الكواشف حصرا LC – MS الصف في الخطوات النهائية (2،11 خطوة وأخرى). تجنب التلوث من التجارب من مصادر البروتين الخارجية ، على سبيل المثال الكيراتين منشؤها من الغبار أو من المجرب. ولا سيما خلال خطوات عملية الهضم النهائي ، فمن المستحسن أن تدفع الانتباه إلى مساحة عمل نظيفة ، وارتداء قفازات ومعطف المختبر ، وربما الشعر الصافي أو أداء مثالي الخطوات النهائية تحت مقعد نظيفة. إعداد الأمونيوم 50 مم بيكربونات العازلة المستخدمة لهضم زيتية في مياه MS LC الصف ، من خلال تصفية 0.22 ميكرون التصفية ، تخزين ، قسامة في -20 درجة مئوية ، واستخدام كل قسامة مرة واحدة فقط لتجنب التلوث. ويمكن تخزين الحل التربسين (تسلسل الرتب ، روش ، وإعداد ميكروغرام 0.5 / ميكرولتر حل عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك إلى 1 ملم التربسين مجفف بالتجميد) في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. ز) يمكن الاعتماد عليها للحصول على الأطياف الشامل فمن الضروري أن يكون هناك رذاذ مستقرة في تحليل ESI-MS/MS. ح) بالنسبة للأنظمة الأخرى LC-MS/MS من تلك التي استخدمت في هذه الدراسة ، لا بد من تعديل معلمات القياس وتحديد خوارزميات الببتيد فردي.
التعديلات التالية ممكنة فيما يتعلق بروتوكول وصف : أ) بدلا من ذلك الى الافراج عن البروتينات من الخرز التي TFA 60 ٪ ACN/0.2 ٪ (الخطوة 2.11) ، يمكن هضم البروتينات مباشرة داخل tryptically تعليق خرزة (نفس حجم كما في الخطوة 5.1) ، أو لSDS – PAGE ، يمكن الافراج عن البروتينات والتدفئة من خلال تعليق الخرز جمعها بعد الخطوة 2،9-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في المخزن عينة SDS (على حد سواء ، وتعليق كامل أو فقط يمكن تحميل طاف في جيب هلام). وجدنا أن حبات الافراج ببطء كميات صغيرة من البوليمر في المحلول المائي خلال هضم زيتية على هضم حبة زيتية حتى بعد عدة خطوات غسل مائي. تلوث البوليمر يتداخل مع تحديد MS الببتيد ، ويمكن غسله باستخدام حبات ACN 80 ٪ (على الأقل ثلاث مرات). بعد الخطوات غسل ACN 80 ٪ ، يجب غسلها بالماء حبات مرة واحدة قبل على هضم حبة زيتية. يمكن ب) أيضا البقع الغربية باستخدام streptavidin – horseraddish البيروكسيداز والركيزة ECL يمكن استخدامها لتصور يشابك الناجح للنسخة التي تحتوي على البيوتين إلى البروتينات. لذا ، إما يمكن الجل الحصول عليها بعد خطوة أو 3.2 نشف ، لأن الحساسية حوالي 10 أضعاف أعلى من تلطيخ فضية المواد الهلامية ، يمكن أيضا عينات 10 ميكرولتر بعد الخطوة التي يتم تحليلها 2.7 لطخة غربية. الاعتبار أنه في الحالة الأخيرة كما البروتينات biotinylated endogeneously يتم الكشف عن جانب البروتينات biotinylated اصطناعيا بواسطة SAH – CC. ج) وجدنا ان هذا الامر يعتمد على نظام خاص (lysate ، تناول البروتينات المستهدفة والانتقائية وظيفة تفاعلية انه CC) ، سواء كان "خارج حبة" التكوين ، حيث رد الفعل يشابك يحدث بين CC الحرة والبروتين في حل 4 أو وصف في الوقت الحاضر "على حبة" التكوين (1B الشكل) أداء أفضل.
بصفة عامة ، ينبغي أن يكون الأسلوب متوافق أيضا مع أي دولة من البروتين الفن النظائر مستقرة أو ببتيد تكنولوجيا التوسيم ، أو تقييم العينة استيلاء هلام إستشراد 2D. في التكوين "خارج حبة" ، فمن الممكن أيضا لالتقاط البروتينات داخل الخلايا بأكمله (نتائج غير منشورة). وعلاوة على ذلك ، يمكن أن أوجز المخدرات أو موقع العامل المساعد ملزمة من البروتين من خلال تحديد موقف يشابك عن قرب من قبل للجنة المركزية ضمن تسلسل تسلسل البروتين الببتيد MS. يمكن استكشاف وضع الملزم للجزيء صغير للبروتين باستخدام مختلف جمواقف مرفق hemical الدالة على الانتقائية وأطوال مختلفة رابط. تناول البروتين أيضا شركاء ملزم للبروتينات كما هو مبين في الدراسة الحالية ، من خلال وظيفة الانتقائية (RplK وركيزة من PrmA) أو البروتين جزيء صغير معروف التفاعلات (SAH لGlnA) يمكن تحديدها. تلخيص ، ميزة إضافية من قانون الأحوال المدنية ، والتفاعل الصور يشابك ، ويسمح للعزلة وتحديد البروتينات وفيرة من البروتين أو الأسر المنخفضة وظيفية من خليط معقد من البروتين مع حساسية عالية ، ويقدم العلماء مع أداة إضافية لدراسة جزيء صغير — تفاعلات البروتين .
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل منظمة الحدودي الإنسان برنامج العلوم (HFSP جائزة عام 2007 ، RGP0058/2007-C). نشكر الأستاذ ريتشارد روبرتس لبدء المشروع وإجراء مناقشات مثمرة.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
SAH caproKit™ | caprotec bioanalytics GmbH | 1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions) |
Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer | |
caproBox™ | caprotec bioanalytics GmbH | 1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V) |
For reproducible photo-activation while cooling the samples | |
caproMag™ | caprotec bioanalytics GmbH | 1-5100-001 | For easy handling of magnetic particles without pipetting |