Vi presenterar ett protokoll för att producera antigenspecifika mus T-celler med hjälp av retrovirus transduktion
T-cell receptorer (TCRs) spelar en central roll i immunförsvaret. TCRs på T-cells ytor kan specifikt känner igen peptid antigener presenteras av antigenpresenterande celler (APC) 1. Detta erkännande leder till aktivering av T-celler och en serie funktionella utfall (t.ex. cytokinproduktionen, dödandet av målet celler). Att förstå den funktionella rollen för TCRs är avgörande för att utnyttja kraften i immunsystemet för att behandla en rad olika immunologiska sjukdomar (t.ex. cancer eller autoimmunitet).
Det är bekvämt att studera TCRs i musmodeller, som kan utföras på flera sätt. Göra TCR transgena musmodeller är kostsamt och tidskrävande och för närvarande finns endast ett begränsat antal av dem tillgängliga 2-4. Alternativt antigen T-celler möss med kan genereras av benmärg chimär. Denna metod tar också flera veckor och kräver sakkunskap 5. Retroviral transduktion av TCRs i in vitro-aktiverade mus T-celler är en snabb och relativt enkel metod för att få T-celler av önskad peptid-MHC specificitet. Antigen-specifika T-celler kan genereras i en vecka och användas i alla tillämpningar i efterföljande led. Studera transduced T-celler har också direkta tillämpningen för människors immunterapi, som adoptiv transfer av humana T-celler transduced med antigen-specifika TCRs är en framväxande strategi för cancerbehandling 6.
Här presenterar vi ett protokoll till retrovirally transduce TCRs i in vitro-aktiverade mus T-celler. Både mänskliga och mus TCR gener kan användas. Retrovirus bär specifika TCR gener genereras och används för att infektera mus T-celler aktiveras med anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar. Efter in vitro-expansion, transduced T-cellerna analyseras med flödescytometri.
Flera steg är avgörande för att uppnå optimala resultat. Plat-E förpackningar cellinje bör förvaras i friskt tillstånd. Vid behov kan cellerna bli passerats ett par gånger i DMEM medium med 1 mikrogram / ml puromycin, 10 mikrogram / ml blasticidin att förhindra förlust av retrovirus struktur proteinuttryck. På dagen för transfektion, bör de celler vara ~ 80% konfluenta. För få eller för många celler kan minska viruset titer. Viruset kvalitet kan kontrolleras genom provning på cellinjer som lätt kan transduced. Sedan TCRs kräver CD3 komplex skall uttryckas på cellytan, vi använder rutinmässigt 58α-/β- Hybridomteknik celler 10 (en cellinje som inte uttrycker endogena TCR α-eller β-kedjan, men uttrycker CD3 komplexet). Vi får nästan 100 verkningsgrad% transduktion av Hybridomteknik celler när transducing celler med 1 ml av virus supernatant. Slutligen T-celler måste aktiveras och prolifererande eftersom retrovirus kan bara infektera aktivt delande celler.
Den metod som presenteras här för att producera antigen-specifika T-celler har flera begränsningar. Det första är det svårt att nå 100% transduktion effektivitet för primär mus T-celler. En del av de celler uttrycker inte TCR av intresse. För det andra transduced TCR α och β kedjorna kan mispair med endogen TCRs 9, vilket kan minska uttryck nivån på TCR av intresse. Dessutom kan de mispaired TCRs orsakar autoimmunitet in vivo 11. Slutligen finns det bara en begränsad tid på transduced T-celler kan användas. Efter ca en vecka, de celler genomgå apoptos om på nytt stimuleras. Dock kan cellerna bli utmattad och förlora funktioner med repetitiva nytt stimuli.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (5U01CA137070) och American Cancer Society (RSG-09-070-01-lib), en Cancer Research Institute Investigator Award (MK), en American Heart Association doktorander gemenskap (KM) och ett spanska ministeriet för utbildning och vetenskap Fellowship (APG).
Vi vill att tacka Dr Nicholas Restifo och Dr Zhiya Yu (NIH / GNI) för hjälp förslag till protokollet.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).