プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。
多くの微生物細胞は自由生活微生物に比べて生理学的および病理学的特性を変更したバイオフィルムのように定義されて付着微生物群集を形成する能力を持っている。自然の中でバイオフィルムは、しばしば不十分な定義された条件1の下で調査し、存在することは困難です。透明な基層を使用して、それはデバイスへの簡単なバイオフィルムをリアルタイムに非破壊的方法で調べることのできるシステムが可能です:ここでは、微生物バイオフィルムの in vitro 3D での研究のために、フローセルのモデルシステムの組み立てと動作を実証明確に定義された条件2,3の下で高い再現性を生成する。
システムは、バイオフィルムの成長チャンバーとして機能するフローセルで構成されています。フローセルは、蠕動ポンプを介して培地フラスコから栄養と酸素を供給され、使用済み培地は、廃棄物の容器に集めている。フローシステムのこの構造は、フローチャンバーで培養した細胞の軽微な障害を持つ栄養素と例えば抗生物質の投与を継続的に供給することができます。また、フローセル内の流れの条件は、せん断応力にさらされるバイオフィルムの研究を可能にする。そうでない場合はフローセル内のバイオフィルムの構造を破壊することができるチューブからデバイスの範囲の気泡をトラップする泡。
フローセルシステムでは、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)と互換性があり、それによって微生物のバイオフィルムの開発についての非常に詳細な3D情報を提供することができます。バイオフィルム中の細胞を蛍光プローブまたはCLSM分析と互換性のあるタンパク質で標識することができます。これはオンラインで可視化を可能にし、開発するバイオフィルムのニッチの調査を可能にします。微生物の相互関係、抗菌剤の調査や特定の遺伝子の発現は、フローセルシステムで調べることができる多くの実験装置のものである。
我々は、バイオフィルムの調査の強力なツールを表すフロー電池システムを実証している。共焦点顕微鏡による3Dイメージングとの組み合わせにより、システムはより伝統的な顕微鏡技術を用いて微生物のバイオフィルムを分析する他の方法と比較して優位性の範囲を持っています。このシステムは、地域の障害なく微生物のバイオフィルムのコミュニティの生活の3D可視化することができます。光学顕微鏡は、バイオフィルムのニッチについての詳細な情報を提供することはありませんし、電子顕微鏡は、バイオフィルムのナノスケールの分解能を提供しますが、それは、生細胞イメージングを許可しません。
、我々は以前にいくつかの抗生物質5-8(図4a)、細胞外化合物の分布に敏感な細菌細胞の空間的分布を解明している説明に従って流路システムを用いたDNA 9月11日などと、の運動性と非運動性細胞の分布細菌群集4,6,9(図4c)内で同じ種。我々は、フローセルシステムは、酵母のバイオフィルムの側面を研究するために使用できることを想像する。これは、殺菌剤だけでなく、酵母のバイオフィルム形成に関与する遺伝子の同定などの環境要因に応答して、酵母のバイオフィルムの時空間的な分布になることがあります。酵母は、運動性と非運動性の細胞に分化することが知られていないものの、バイオフィルムの多様化の他の側面は、そのような酵母から偽菌糸細胞に形態学的変化と一倍から二倍体細胞へのシフトなどの研究があります。
我々は、いくつかの微生物種を遵守し、いくつかの染色技術で動作するシステムを示している。異なる染色プローブやGFPなどの蛍光タンパク質、様々な、発展途上バイオフィルム内の特定のニッチの調査を有効にして、抗菌剤または他の環境要因の影響を分析する効果的なツールです。得ることができる情報は非常に詳しいです(図4)とバイオフィルムの特徴は、犯罪統計システム12,13のようなコンピュータプログラムを使用して定量することができる。
全体的に、プロトコルの最も重要な側面は、それは時間のかかるプロセスであるという事実である。また、細胞は非蛍光、透明な表面上に成長できるようにするために必要な制限です。このシステムは、経験豊富な研究者として、ハイスループットスクリーニングに適していない。形成されたバイオフィルムは、共焦点顕微鏡、数百ミクロン14に制限されて調査することができる深さを用いて分析されるので、設計に内在するさらなる技術的な制限があります。順番に準備するために数日かかることが実験で、あたりのほとんどの約15チャンネルで扱うことができます。最も興味深いの候補者がフローセルシステムに転送される前に、しかし、バイオフィルムの研究のために適切と見なされている抗生物質や変異体は、当初の質量などのクリスタルバイオレット染色など他の方法でスクリーニングすることができる。カバーガラスのシートは非常に細く、壊れやすい、とシステムを取り扱う際は注意が必要です。さらに、チューブは、実験の実行中に毎日検査されるべきである。フローセルのすぐ上流インレットチューブでかなりの"バック成長"としては、発生する可能性があります。そのような汚染は、無菌操作を使用して、フローセルの入口側からシリコンチューブの数センチを削除すれば解決することができます。
図4)4日目のPAO1 – 。死んだ染色(赤色染色)b)の三日間の3Dプレゼンテーション古いP.用コリスチンおよびヨウ化プロピジウムで24時間の治療を受けてGFPのバイオフィルム緑膿菌 PAO1( 緑膿菌野生型) – GFPバイオフィルムC 6)PAO1の3D画像のプレゼンテーション- PAO1野生型YFP(黄色)DとCFP pilumの複数形変異体(青))5日齢のPAO1 – GFPバイオフィルムは3Dとして提示画像E)26時間S.出芽酵母 (CEN.PKのバックグラウンドでPTR3変異体)SYTO – 9 15で染色したバイオフィルム。
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |