Summary
Протокол описывающих применение системы проточной ячейки для выращивания и анализа микробной биопленки для конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM).
Abstract
Многие микробных клеток есть способность образовывать сидячие микробных сообществ определяется как биопленки, что изменились физиологические и патологические свойства по сравнению с свободной микроорганизмов, обитающих. Биопленки в природе часто трудно провести расследование и проживают в плохо определенных условиях 1. Использование прозрачной субстрата можно устройстве системы, в которой простые биопленки могут быть изучены в неразрушающим способом в режиме реального времени: здесь мы демонстрируем сборки и эксплуатации модели системы проточной кюветы для лабораторного исследования 3D микробных биопленок генерации высокую воспроизводимость при определенных условиях 2,3.
Система состоит из проточной ячейки, которая служит рост камера для биопленки. Проточная ячейка снабжена питательных веществ и кислорода из среды колбу с помощью перистальтического насоса и провел среду собирается в контейнер для отходов. Такое построение системы позволяет потока непрерывного поступления питательных веществ и управления, например, антибиотиков с минимальным нарушением клеток, выращенных в проточную камеру. Более того, условия потока в проточной ячейке позволяет исследования биопленки воздействию напряжения сдвига. Пузыря захвата устройства пузырьки воздуха от границ трубки, которые иначе могут нарушить структуру биопленки в потоке клеток.
Система проточной ячейки совместим с конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM) и может таким образом обеспечить высоко детализированные 3D сведения о разработке микробных биопленок. Ячейки в биопленки могут быть помечены флуоресцентных зондов или белки совместимы с CLSM анализа. Это позволяет в оперативном режиме визуализацию и позволяет исследовать ниши в развивающихся биопленки. Микробная взаимосвязь, изучение антимикробных агентов или выражения специфических генов, имеют много экспериментальных установок, которые могут быть исследованы в системе клетка потока.
Protocol
1. Ассамблея системы Сотовые потока со всеми компонентами
Собранный потока система включает в себя: автоклавируемый труб, пузырь ловушки, средний / бутылка для отходов и расхода клетки, как показано на рисунке 1. Все эти части могут быть повторно использованы между экспериментами.
Рисунок 1. Системы проточной ячейке установки (основные компоненты установки). Система проточной ячейки состоит из нескольких компонентов: среда бутылку, перистальтического насоса, пузырь ловушки, поток ячейки, бутылка для отходов, а также различных участков трубы между собой различные разъемы. Рис любезно предоставлены Руне Lyngklip.
2. Ассамблея Проточная ячейка
- Проточной ячейки (рис. 2а) обрабатывают тонкие полосы клея силикон, при помощи шприца (рис. 3).
- Место покровным стеклом поверх линий силикона (рис. 3). Стеклянная крышка скользит используются в качестве субстрата для P. палочки в то время как скользит ПВХ покрытие применяется для S. CEREVISIAE биопленки.
Рисунок 2. Схематическое изображение клеточного потока и пузырь ловушку 2. Подробное описание размеры, используемые для производства) проточной ячейки б) пузырь ловушку, DTU системной биологии. Печатается с разрешения John Wiley & Sons, Inc (DTU системной биологии ранее озаглавленной Biocentrum, как показано на рисунке)
Рисунок 3. Иллюстрация из силиконового клея линий для крепления стекла субстрата. Указано стеклянной крышкой находится над силиконовым клеем, чтобы прикрепить ее к проточной ячейки.
- Включите проточной ячейки снова и положите его на плоскую поверхность с боковой крышки опускаются вниз. Пресс мягко на задней проточной ячейке нажать покровным стеклом на базу проточной ячейки. Включите проточной ячейки снова и проверьте их на областях, которые не опечатаны силикона. Ручку (поршневой) часть шприца может быть использована как инструмент аккуратно нажмите стекла и проточной ячейки вместе.
3. Средний бутылки
- Место кормления силиконовой трубкой (2 мм внутренний диаметр) в среде бутылку и вставьте прямой разъем на другом конце.
- Добавить средних бутылки (для среднего содержания см. в разделе "СМИ" абзац)
Крышка разъема и бутылка с металлической фольги и автоклавного среды. Убедитесь, что к концу питания трубки закрепиться выше уровня жидкости в среднесрочной бутылку или сифон эффект может пустые бутылки, когда средний автоклавирования.
4. Подключение Bubble Ловушка, Сотовые расхода и насосы
Соберите все трубопроводы в соответствии с планом на рисунке 1. Используйте силиконовые трубки, за исключением части, которая проходит через перистальтического насоса, где Marprene трубки применяется.
- Для подключения трубки из среды бутылки для всех отдельных камерах потока, разделение трубку в необходимом количестве вводов применяются в эксперименте. Использование T-разъемы, чтобы сделать желательные количество соединений труб из трубки подачи на Marprene труб в насос (см. рисунок 1, Т-коннектор). Как правило, это хорошая идея, чтобы сохранить тот же порядок следования труб и поток клетки во всей системе, чтобы облегчить идентификацию компонентов в случае неисправности в системе.
- Подключение каждого кормления трубки (2 мм в диаметре), чтобы Marprene трубы насоса, используя прямые разъемы. Подключите Marprene НКТ пузырь ловушку (рис. 2, б) через промежуточные трубки силиконовые (1 мм в диаметре). Убедитесь, что насос подключен к входу на высоких часть пузыря ловушку.
- Подключите результате отводной трубки пузыря ловушки на входе проточной ячейки (1 мм в диаметре), убедитесь, что длина этих трубки позволяет проточной ячейке должен быть переведен в стадию конфокальной микроскопии (обычно 1 м).
- Место 5 мл шприцев на вершине пузыря ловушки. Закрыть вершины с соответствующими крышками.
- На выходе ячейки поток подключения Короче говоря, примерно на 40 мм часть (1 мм в диаметре), трубы и использовать "сокращение" прямой разъем приложить отходов трубки (2 мм в диаметре), необходимой длины. Поместите отходы труб в контейнер для отходов.
- Важно отметить, что контейнер для отходов должны всегда быть размещены на том же уровне, как поток клеток, не ниже потока клеточном уровне. Кроме того, убедитесь, что конец отходов трубки крепится выше ожидаемого уровня жидких отходов, чтобы избежать скрытого назад из-за сифона эффект при работе с потоком клеток.
5. Стерилизации и мытья проточной системы
- Удалить колпачки пузырь ловушки и поместите их в 70% этанола, чтобы держать их стерильными.
- Выполнить на самом высоком скорости насоса для заполнения системы с 0,5% (объем / объем) гипохлорита натрия в воде. </ LI>
- Место шапки пузырь ловушку назад о том, когда пузырь ловушки полностью заполнены.
- Нажмите проточные кюветы для удаления пузырьков в потоке камеры. Будьте осторожны, чтобы не повредить хрупкие стеклянные крышки.
- Разрешить системы для стерилизации в течение 3-4 ч при скорости потока 3 мл / ч / канал (0,2 мм / с линейной скоростью потока).
- Вымойте системы в 2-3 раза, чтобы смыть все гипохлорита. Заполнить и пустые системы стерильной водой. Bubble ловушки должна быть очищена полностью между каждой стирки. Это может быть сделано путем откачки в воздухе, пока пузырь ловушки были очищены. После опорожнения, удаления крышки с пузырем ловушки перед заправкой системы. Замените шапки после пузыря ловушки были полностью заполнены жидкостью. Повторите по мере необходимости.
- Выполнить стерильной воды через систему при низкой скорости потока (1-3 мл / ч / канал) в течение ночи или перейти к следующему шагу.
- Подключите среду бутылку входе и промыть систему со средней в течение ночи при низкой скорости потока (3 мл / ч / канал) при температуре, при которой эксперимент будет выполнена. Примечание: пузырь ловушки должны быть очищены для воды, прежде чем система заполнена средой.
6. Инокуляции Проточная ячейка
- С ночной культуры делают разбавления до желаемой оптической плотности (для P. палочки, например, 0,001 ОП 600 нм и 0,1 OD 600 нм для CEREVISIAE С.).
- Используйте 0,5 мл шприц с иглой 27G для загрузки посевного достаточно, чтобы заполнить камеру. 250 мкл достаточно для проточных камерах, имеющих размеры, указанные в этой работе (рис. 2., 40 мм х 4 мм х 1 мм).
- Стоп перистальтического насоса.
- Зажим с силиконовой трубки, ведущие к проточной ячейки для предотвращения обратного потока в системе.
- Стерилизовать прививки сайта на силиконовые трубки, протерев его с 70% этанола.
- Вставьте иглу в силиконовую трубку и ввести наконечник в входе в потоке клеток. Медленно вводят посевной в камеру (будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки воздуха).
- Удалите иглу и протереть место инъекции с 70% этанола с последующим немедленным герметизации отверстие с помощью силиконового клея на месте инъекции.
- Переверните проточной ячейки и пусть микроорганизмов придерживаться субстрата в течение 1 часа без потока через измерительную ячейку.
- Включите измерительную ячейку, запустить среду насоса (3 мл / ч / канал) и принять зажим с силиконовой трубкой.
- Система будет выставлена на инкубации при температуре 37 ° С в случае P. палочки и 30 ° С в случае С. CEREVISIAE.
- Биопленки в потоке камеры теперь могут быть визуализированы CLSM.
7. Окрашивание биопленки для микроскопии
- Сделать разбавление соответствующей окраски (например, 1:1000 Syto 9 жить пятно для CEREVISIAE С.)
- Стоп перистальтического насоса.
- Фиксатор силиконовые трубки, ведущие к проточной ячейки.
- Стерилизовать прививки сайта на силиконовые трубки, протерев его с 70% этанола.
- Используйте 0,5 мл шприц с иглой 27G для загрузки достаточно решения окрашивания, чтобы заполнить камеру. 250 мкл достаточно для проточных камерах использованы здесь.
- Вставьте иглу в силиконовую трубку и ввести наконечник в входе в потоке клеток. Медленно вводить окрашивание раствора в камере (будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков).
- Удалите иглу и протереть место инъекции с 70% этанола с последующим немедленным уплотнение в месте инъекции.
- Оставьте проточной ячейки без потока в течение 15 минут.
- Снимите зажим и начать поток (3 мл / ч / канал)
- Приобретать данных с CLSM
Discussion
Мы показали, система проточной ячейки, которая представляет собой мощный инструмент в биопленки исследований. В сочетании с 3D-визуализации с помощью конфокальной микроскопии, система имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами анализа микробной биопленки с помощью более традиционных микроскопических методов. Эта система позволяет 3D визуализация жизни микробных сообществ биопленки без нарушения сообщества. Световая микроскопия не будет предоставлять подробную информацию о нишах биопленки и в то время как электронная микроскопия обеспечивает нано разрешением биопленки, он не позволяет жить изображений клеток.
Использование описанной системе течения в канале мы уже выяснены пространственного распределения бактериальной клетки, чувствительные к нескольким антибиотикам 5-8 (рис. 4а), распределение внеклеточных соединений, например, ДНК 9-11 и распределение подвижных и неподвижных клетки же вида в течение бактериального сообщества 4,6,9 (рис. 4в). Мы предполагаем, что поток в системе клетка может быть использован для изучения аспектов дрожжей биопленки. Это может быть пространственно временного распределения дрожжей биопленки в ответ на экологические факторы, такие как фунгициды, а также идентификация генов, вовлеченных в развитие дрожжей биопленки. Хотя дрожжи не известно дифференцироваться в подвижные и неподвижные клетки, другие аспекты диверсификации биопленки могут быть исследования, такие как морфологический переход от дрожжей до pseudohyphal клетки и переход от гаплоидных для диплоидных клеток.
Мы показали, что система соответствует несколько видов микроорганизмов и будет работать с несколькими методами окрашивания. Различных зондов окрашивания и флуоресцентные белки, такие как GFP, включите конкретных расследований нишу в развивающемся биопленки и является эффективным инструментом для анализа влияния антимикробных препаратов или других факторов окружающей среды. Информации, которая может быть получена очень подробно (рис. 4) и возможности в биопленки могут быть количественно с компьютерными программами, такими как КОМСТАТ 12,13.
В целом, наиболее важным аспектом протокола является то, что это трудоемкий процесс. Кроме того, ограничения, что клетки должны быть способны расти на не-люминесцентные, прозрачной поверхности. . С биопленки образуются анализируется с помощью конфокальной микроскопии, глубина, которые могут быть исследованы ограничен до нескольких сотен микрометров 14 Есть и другие технические ограничения, присущие дизайн: система не подходит для высокопроизводительного скрининга, как опытный исследователь может работать не более чем около 15 каналов на каждый эксперимент, который, в свою очередь, может занять несколько дней, чтобы подготовиться. Тем не менее, антибиотики или мутанты, которые считаются актуальными для биопленки исследования могут быть изначально массу экранированный с другими методами, такими, как кристалл фиолетового окрашивания до наиболее интересных кандидатов передаются системой проточной кюветы. Титульные листы стекла очень тонкие и легко ломаются, и следует проявлять осторожность при работе с системами. Кроме того трубки должны быть рассмотрены в день во время запуска эксперимента, как значительный "назад-рост" во впускной трубы чуть выше по течению потока клетки может произойти. Такое загрязнение может быть решена путем удаления нескольких сантиметров силиконовые трубки от входа стороне потока клеток, с использованием стерильной техники.
Рисунок 4) 4 день старого PAO1 -. GFP биопленки рассматриваются в течение 24 часов с Колистин и пропидий йодида для мертвых окрашивания (красное пятно) б) 3D презентация три дня старый P. PAO1 палочки (P. палочки дикого типа) - GFP биопленки 6, в) 3D изображение презентация PAO1 - CFP Пила мутант (синий) с PAO1 дикого типа YFP (желтый) г) 5 дневных PAO1 - GFP биопленки представлены как 3D картина электронной) 26 ч С. CEREVISIAE (PTR3 мутанта в CEN.PK фоне) биопленки окрашивали Syto-9 15.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
Tubing:
Media
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Growing and analyzing biofilms in flow cells. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).
- Heydorn, A.
- Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).
- Haagensen, J. A. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).
- Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).
- Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes. Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).
- Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy. Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).
- Barken, K. B. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).
- Qin, Z. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: http://www.comstat.dk/ (2010).
- Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).
- Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).
