Summary
协议描述流通池系统中的应用激光共聚焦显微镜（CLSM）为不断发展和分析微生物生物膜。
Abstract
许多微生物细胞的能力，形成社区定义为改变相比，免费的活体微生物的生理和病理性质生物膜固着微生物。生物膜的性质往往难以进行调查，居住在定义不清的条件1。采用了透明的底层，它是可能的设备，一个简单的生物膜可以在一个非破坏性的方式检查实时系统：在这里我们展示了一个流动的细胞模型系统的装配和操作，在体外三维微生物生物膜研究根据定义良好的条件2,3高重现性。
该系统由一个流单元，可作为生物膜的生长室。通过蠕动泵和流通池提供的营养物质和氧气从中期瓶中花中型物的容器收集。这种流系统的建设使干扰最小流室中生长的细胞的营养物质，如抗生素管理的持续供应。此外，流细胞内的流动条件允许的情况下暴露于剪应力的生物膜研究。泡沫捕集设备的局限，从管，否则可能会破坏在流动细胞的生物膜结构的气泡。
流通池系统，激光共聚焦显微镜（CLSM）兼容，从而可以提供非常详细的有关开发微生物生物膜的三维信息。细胞的生物膜可以兼容CLSM分析与荧光探针或蛋白质的标记。这使得网上可视化，并允许在发展中生物膜的壁龛的调查。微生物的相互关系，调查抗菌剂或特定基因的表达，流电池系统，可在调查的许多实验设置。
Protocol
1。大会的流通池系统所有组件
组装流系统包括：高压灭菌管，泡沫陷阱，中/废液瓶，如在图1所示的流细胞。所有这些部件可重复使用实验之间。
图1。流通池的系统设置程序（设置的重要组成部分） 。流电池系统由几部分组成：一个中等瓶，蠕动泵，泡沫陷阱，流通池，废液瓶，以及多样化的油管通过各种连接器相互连接的部分。请提供图符文Lyngklip。
2。大会流通池
- 薄小巷，硅酮胶，用注射器（图3），流动池（图2a）治疗。
- 将盖玻片上的硅胶线（图3）的顶部。玻璃盖玻片作为底层为 P 铜绿而PVC盖玻片申请为S.酵母生物膜。
图2示意图流动细胞和泡沫陷阱2。详细说明用于生产一）流动池二）泡沫陷阱，DTU的系统生物学的尺寸。约翰威利父子公司（DTU的系统生物学的前身题为“Biocentrum，在图所示）许可重印
图3。插图的硅酮胶玻璃基质的附件中的应用线。表示玻璃盖放置在硅酮胶，将其附加到流通池。
- 打开流动池，并放置在一个平坦的表面与盖玻片的一面朝下。按流动池的背面，轻轻推到流动池底部的盖玻片。打开流动池和检查不是由硅酮密封的地区。手柄（活塞）注射器的一部分可以用来作为一种工具，轻轻按下玻璃和流通池。
3。中等瓶
- 放置在一个中等瓶喂食硅胶管（内径2毫米），并插入另一端的直连。
- 中瓶（介质内容，请参阅“媒体”段）
盖连接器，金属箔和瓶和高压灭菌的培养基。确保供应管固定在中期瓶或虹吸作用的液位以上可能中期瓶空时，高压灭菌。
4。连接泡沫陷阱，流通池和泵
根据图1中的提纲，收集所有管线。除部分通过蠕动泵Marprene管硅胶管。
- 为了连接所有个别流动商会从中期瓶管，分割成所需数量，在实验中采用的进气口管。使用T -连接器从进料管连接管的理想Marprene泵管（见图1，T型接头）。它通常是一个好主意，让整个系统管和流动细胞相同的顺序，在系统发生故障的情况下的部件，以方便识别。
- 每一个人的喂食管（直径为2毫米）连接，Marprene在使用直连接器的泵管。通过中间的硅胶管（直径1毫米）连接到泡沫陷阱Marprene管（图2b）。确保泵入口连接在泡沫陷阱最高。
- 泡沫陷阱造成的出口管连接到流通池入口（直径1毫米），确保这些管材的长度可以被转移到流通池共聚焦显微镜（通常为1米）的阶段。
- 放置在顶部的泡沫陷阱5毫升注射器。关闭合适的帽子的上衣。
- 对流动细胞插座短，约40毫米片（直径1毫米），管材连接，并使用一个“减少”直连附加所需长度的废物管（直径2毫米）。废物的容器放置在废物管。
- 重要的是，废物的容器必须始终置于在同一水平流细胞，流动细胞水平从未低于。此外，还要确保废物管到底是上述废液的预期水平固定，避免冲洗处理流细胞时，由于虹吸效应。
5。消毒和洗涤流动系统
- 删除泡沫陷阱帽和70％的乙醇，以保持他们的无菌。
- 运行在最高的泵的转速，以填补与0.5％（V / V）钠水的次氯酸钠系统</ LI>
- 泡沫陷阱盖放回原处时完全充满泡沫陷阱。
- 点击流细胞流动室，以消除气泡。小心不要破坏脆弱的玻璃盖。
- 允许系统在流速为3 ml / H /通道（0.2 mm / s的线性流速）消毒3-4小时。
- 清洗系统的2-3倍，洗出所有的次氯酸钠。填充和空用无菌水系统。必须清空完全相互间洗泡沫陷阱。这可以通过在空气中抽水，直到泡沫陷阱已清空。排空后，加气站的系统之前，去除泡沫陷阱的上限。更换后泡沫陷阱已经完全充满液体的上限。根据需要重复。
- 无菌水通过该系统运行在一个低流量（1-3毫升/ H /通道）在夜间或进行下一步。
- 中期瓶连接的入口和冲洗系统在低流速（3毫升/小时/通道），在那里将进行实验的温度在夜间语言。注：泡沫陷阱，必须对水排空系统之前，充满中等。
6。接种流动池
- 从培养过夜，稀释到所需的光密度 （绿脓杆菌如0.001 OD 600nm处和0.1 OD 600nm处酵母）。
- 使用与27G针0.5毫升注射器加载足够的接种，以填补室。 250μL，是足够的流量，在这项工作中指定的尺寸（图2，40毫米x 4毫米× 1毫米）商会。
- 停止蠕动泵。
- 钳断的硅胶管，导致流通池进入系统，以防止流动。
- 用70％乙醇擦拭消毒接种部位上的硅胶管。
- 硅胶管插入针头，并引入流通池入口的提示。慢慢注入接种室（要小心，不要注入气泡）。
- 取出针，并用70％乙醇擦拭注射部位，随后使用硅酮胶在注射部位的孔立即密封。
- 翻转流动池，并让没有流过流通池1小时的微生物坚持到底层。
- 打开流动池，启动介质的泵（3毫升/小时/通道），并采取关闭硅胶管钳。
- 该系统是放在孵化，在37 °的P.彗星铜绿微囊藻和30 ° C的情况下的S.酵母 。
- 生物膜流室，现在可以由CLSM观察。
7。生物膜显微镜染色
- 做一个适当的染色稀释（如1:1000祥发9住酿酒酵母中的污点）
- 停止蠕动泵。
- 钳的硅胶管，导致流动池。
- 用70％乙醇擦拭消毒接种网站上的硅胶管。
- 使用与27G针0.5毫升注射器加载足够的染色溶液，填补了会议厅。 250μL，这里所用的足够的流动商会。
- 硅胶管插入针头，并引入流通池入口的提示。慢慢注入进入会议厅的染色溶液（小心，不要注入气泡）。
- 取出针，并用70％乙醇擦拭注射部位，注射部位立即密封。
- 离开15分钟的流量流通池。
- 起飞钳，并开始流（3毫升/ H /通道）
- 数据采集与CLSM
Discussion
我们已经证明了一个流动池的系统，在生物膜调查强大的工具。结合三维成像共聚焦显微镜，该系统已在其他更传统的显微技术分析微生物生物膜方法相比的优势范围。这个系统允许没有扰乱社会生活中的微生物生物膜社区的三维可视化。光镜将不提供有关生物膜龛的详细信息，而电子显微镜提供纳米级分辨率的生物膜，它不会允许活细胞成像。
使用我们先前已经阐明5-8（图4a）几种抗生素敏感，细菌细胞外化合物分布的空间分布的描述的流道系统， 如DNA 9-11和的活动和非活动细胞的分布同一物种内的细菌群落4,6,9（图4c）。我们设想，流通池系统可以被用来研究酵母生物膜方面。这可能是环境因素，如杀菌剂以及识别有关的基因在酵母中生物膜的发展酵母生物膜的时空时空分布。虽然酵母是不知道的活动和非活动的细胞分化成其他生物膜的多样化方面，可从酵母到假菌丝细胞形态的转变和从单倍体二倍体细胞的转移，如研究。
我们已经表明系统符合一些微生物物种，并会与几个染色技术。各种不同的染色探针和荧光蛋白如GFP，使在发展中生物膜的具体利基调查和分析抗菌药物或其他环境因素的影响是一个有效的工具。可以得到的信息是非常详细（图4），在生物膜的功能，可以与计算机程序，如COMSTAT 12,13量化。
总体来说，协议的最关键的环节是事实，即它是一个耗时的过程。这也是一个限制，即细胞能够生长在一个无荧光，透明的表面。由于生物膜的形成是使用共聚焦显微镜，是有限的，以几百微米14的深度，可以调查分析，有进一步的技术在设计中所固有的局限性：高通量筛选系统是不适合作为一个经验丰富的研究员，可以处理在大多数实验中，大约15％的渠道，这反过来可能需要数天准备。然而，抗生素或生物膜的研究被认为有关的突变体，最初可以与其他方法，如结晶紫染色筛选最有趣的候选人之前转移到流通池系统的质量。盖玻璃板非常薄，容易折断，处理系统时，应小心。此外，应检查油管每天一个实验运行期间，可能会出现相当大的“回到增长”只是上游的流量细胞的入口管。从几厘米的硅胶管，进气侧流细胞通过消除这种污染是可以解决的，用无菌技术。
图4 A）4日龄PAO1 -绿色荧光蛋白生物膜粘菌素和碘化丙啶治疗24小时死染色（红染色）B）为期三天的3D演示老体育假单胞菌 PAO1（ 铜绿假单胞菌野生型） -绿色荧光蛋白生物膜6 C）3D一个PAO1图片演示- CFP皮拉突变（蓝色）一个PAO1野生型YFP（黄色）D）5天的老PAO1 -绿色荧光蛋白生物膜作为3D图片发送）26 H S。沾满酵母 （PTR3 CEN.PK背景突变）生物膜与祥发，9月15日 。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
Tubing:
Media
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References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Growing and analyzing biofilms in flow cells. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).
- Heydorn, A.
- Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).
- Haagensen, J. A. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).
- Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).
- Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes. Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).
- Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy. Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).
- Barken, K. B. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).
- Qin, Z. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: http://www.comstat.dk/ (2010).
- Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).
- Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).
