프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.
대부분의 미생물 세포는 무료 생활 미생물에 비해 생리와 병리 학적 특성을 변경하지 biofilms로 정의 고착의 미생물 커뮤니티를 형성하는 능력이 있습니다. 자연 Biofilms 종종 제대로 정의된 조건 1 아래 조사하고 거주하기가 어렵습니다. 투명 하층을 사용하면 그것은 장치에 간단한 biofilms가 실시간으로 비파괴 방식으로 검사 수있는 시스템이 가능합니다 : 여기 우리는 미생물 biofilms의 체외 3D 연구에 대해, 플로우 셀 모델 시스템의 조립 및 작동을 보여주 잘 정의된 조건 하에서 높은 재현성 2,3 생성.
시스템은 biofilm에 대한 성장 챔버 역할 흐름 세포로 구성되어 있습니다. 흐름 세포는 연동 펌프를 통해 매체를 플라스크에서 영양분과 산소와 함께 제공하고 소비 매체는 폐기물 용기에 수집됩니다. 흐름 시스템의 건설 흐름 챔버에서 자란 세포의 최소한의 방해와 예, 항생제의 영양분과 행정의 지속적인 공급이 가능합니다. 또한, 흐름 세포 내에서 유동 조건 전단 응력에 노출 biofilm의 연구를 수 있습니다. 풍선 달리 흐름 세포의 biofilm 구조를 방해 할 수있는 튜브에서 장치 경계 공기 방울을 트래핑.
흐름 전지 시스템은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)와 호환되며 따라서 미생물 biofilms을 개발하는 방법에 대해 매우 상세한 3 차원 정보를 제공할 수 있습니다. biofilm의 세포는 형광 프로브 또는 CLSM 분석과 호환 단백질이 표시하실 수 있습니다. 이것은 온라인 시각화를 가능하게하고 개발 biofilm의 틈새 시장의 조사를 허용합니다. 미생물 상호 관계, 항균 대리인 또는 특정 유전자의 표현의 조사는 흐름 전지 시스템의 조사 수있는 많은 실험 설정을합니다.
우리는 biofilm 조사에서 강력한 도구를 나타내는 플로우 전지 시스템를 증명하고있다. 공촛점 현미경의 3D 이미지와 결합 시스템은보다 전통적인 현미경 기술에 의해 미생물 biofilms를 분석의 다른 방법에 비해 장점 범위 있습니다. 이 시스템은 지역 사회의 방해없이 미생물 biofilm 커뮤니티를 생활의 3D 시각화 수 있습니다. 가벼운 현미경은 biofilm의 틈새에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다과 전자 현미경의 biofilm의 nanoscale 해상도를 제공하는 동안, 그것은 라이브 셀 이미징을 허용하지 않습니다.
우리가 이전에 여러 항생제 5-8 (그림 4A)에 민감한 박테리아 세포, 세포 성분의 분포의 공간적 분포를 elucidated있는 설명 유동 채널 시스템을 사용하여, 예를 들어 DNA 9-11와의 운동성이있는가 아닌 운동성이있는 세포의 분포 박테리아 커뮤니티 4,6,9 (그림 4C)에서 동일한 종. 우리는 흐름 전지 시스템은 효모 biofilms의 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 것을 다할. 이것은 fungicides뿐만 아니라 효모 biofilm 개발에 관여 유전자의 식별과 같은 환경 요인에 대한 응답으로 효모 biofilm의 spatio 시간적 분포 수 있습니다. 효모는 운동성이있는과 비 운동성이있는 세포로 구별하는 것으로 알려져 아니지만, biofilm의 다변화의 다른 측면은 효모에서 pseudohyphal 세포에 대한 형태학의 변화와 haploid에서 diploid 세포로의 전환으로 공부를 할 수 있습니다.
우리는 여러 미생물 종의 준수와 여러 얼룩 기술과 함께 사용할 수있는 시스템을 보여주었다. 같은 GFP 등 다양한 얼룩 프로브 및 형광 단백질의 다양한, 개발 biofilm의 특정 틈새 조사를 활성화하고 항균 대리인 또는 기타 환경 요인의 효과를 분석 효율적인 도구입니다. 얻은 수있는 정보는 매우 상세한있다 (그림 4)와 biofilm의 기능은 같은 COMSTAT 12,13와 같은 컴퓨터 프로그램과 계량 수 있습니다.
전체 프로토콜의 가장 중요한 측면은 그것이 시간이 많이 걸리는 과정이라는 사실이다. 또한 세포가 아닌 형광등, 투명 표면에 성장 수 있어야한다는 제한 사항입니다. . 시스템이 경험 연구원으로 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다 : 형성된 biofilm이 공촛점 현미경, 몇 백 micrometres 14 제한됩니다 조사 수있는 깊이를 사용하여 분석하기 때문에 디자인에 고유의 추가 기술 한계가 있습니다 차례 준비하는 데 몇 일이 소요될 수 있습니다 실험마다 대부분의 약 15 개 채널에서 처리할 수 있습니다. 그러나, biofilm 연구 관련 간주되는 항생제 또는 돌연변이가 처음에는 가장 흥미로운 후보가 흐름 전지 시스템으로 전송되기 전에 이러한 크리스탈 바이올렛 얼룩 같은 다른 방법으로 검사를 대량 수 있습니다. 커버 유리 시트는 매우 얇은하고 쉽게 휴식, 그리고 시스템을 다룰 때주의한다. 또한 튜브는 실험의 실행 기간 동안 매일 검사해야한다 단지 상류 흐름 세포의 유입 튜브에 상당한 "다시 성장은"발생할 수있는. 이러한 오염 물질은 멸균 기술을 사용하여 흐름 세포의 입구 측면에서 실리콘 튜브의 여러 센티미터를 제거하여 해결하실 수 있습니다.
그림 4) 사일 오래된 PAO1 -. 죽은 얼룩 (붉은 얼룩) B)는 3 일의 3D 프레 젠 테이션을 이전 P. 대한 Colistin 및 Propidium 요오드화물과 24 시간의 치료를 GFP의 biofilm 녹농균이라는 박테리아 PAO1 (P.의 녹농균이라는 박테리아 야생 타입) – GFP biofilm 6 C) PAO1의 3D 사진 프레 젠 테이션 – PAO1 야생 유형 YFP (노란색) D와 CFP 필라 돌연변이 (블루)) 오일 오래된 PAO1 – GFP biofilm은 3D로 표시 그림 E) 26 H S. cerevisiae (CEN.PK 배경으로 PTR3 돌연변이) biofilm은 Syto – 9 15 물들다.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |