Protokoll som beskriver tillämpningen av ett flöde cellsystem för växande och analysera mikrobiella biofilmer för Confocal laserscanning Mikroskopi (CLSM).
Många mikrobiella celler har förmågan att bilda fastsittande mikrobiella samhällen definieras som biofilmer som har ändrats fysiologiska och patologiska egenskaper jämfört med fritt levande mikroorganismer. Biofilmer i naturen är ofta svåra att utreda och vistas i dåligt definierade villkor 1. Med hjälp av en transparent underlag är det möjligt att enheten ett system där enkla biofilmer kan undersökas på ett icke-förstörande sätt i realtid: här har vi demonstrera montering och drift av en flödescell modellsystem, för in vitro 3D studier av mikrobiella biofilmer generera hög reproducerbarhet enligt noga fastställda villkor 2,3.
Systemet består av ett flöde cell som fungerar som tillväxt kammare för biofilmen. Flödet cellen levereras med näringsämnen och syre från ett medium kolv via en Slangpumpar och tillbringade mediet samlas upp i en avfallsbehållare. Denna konstruktion av flödet systemet tillåter en kontinuerlig tillförsel av näringsämnen och administration av t.ex. antibiotika med minimal störning av celler som odlas i flödet kammaren. Dessutom flödesförhållanden inom flödescellen möjliggör studier av biofilm utsätts för skjuvspänning. En bubbla fånga anordning begränsar luftbubblor från slangen som annars kan störa biofilmen struktur i flödet cellen.
Flödet cellen systemet är kompatibelt med Confocal laserscanning Mikroskopi (CLSM) och kan därmed ge mycket detaljerad 3D-information om att utveckla mikrobiella biofilmer. Celler i biofilmen kan vara märkt med fluorescerande prober eller proteiner kompatibel med CLSM analys. Detta möjliggör online-visualisering och tillåter undersökning av nischer i utvecklingsländerna biofilmen. Mikrobiell inbördes, undersökning av antimikrobiella medel eller uttrycket av specifika gener, är av de många experimentella uppställningar som kan undersökas i flödescellen systemet.
Vi har visat ett flöde cell som utgör ett kraftfullt redskap i biofilmen utredningar. Kombinerat med 3D-avbildning av konfokalmikroskopi, har systemet en rad fördelar i jämförelse med andra metoder för att analysera mikrobiella biofilmer med hjälp av mer traditionella mikroskopiska tekniker. Detta system möjliggör 3D-visualisering av levande mikrobiell biofilm samhällen utan störningar i samhället. Ljusmikroskopi kommer inte att ge detaljerad information om nischer av biofilm och medan elektron mikroskopi ger nanoskala upplösning biofilm, tillåter den inte levande cell imaging.
Använda beskrivna systemet flödeskanal Vi har tidigare belyst den geografiska fördelningen av bakterieceller känslig för flera antibiotika 5-8 (figur 4a), distribution av extracellulära ämnen, t.ex. DNA 9-11 och distribution av rörliga och icke rörliga celler samma art inom en bakteriell gemenskap 4,6,9 (Figur 4c). Vi ser framför oss att flödet cellen systemet kan användas för att studera aspekter av jäst biofilmer. Detta kan vara rums tidsmässig fördelning av jäst biofilm som svar på miljöfaktorer såsom fungicider samt identifiering av gener involverade i jäst biofilmen utveckling. Även jäst inte är känd för att differentieras till rörliga och icke rörliga celler kan även andra aspekter på biofilm diversifiering vara studier såsom morfologiska övergången från jäst till pseudohyphal celler och skiftet från haploida till diploida celler.
Vi har visat ett system som uppfyller ett antal mikroorganismer och kommer att arbeta med flera färgningsteknik. En rad olika färgning sonder och fluorescerande proteiner, såsom GFP, aktivera specifik nisch undersökningar i utvecklingsländerna biofilm och är ett effektivt verktyg för att analysera effekten av antimikrobiella medel eller andra miljöfaktorer. Den information som kan vinnas är mycket detaljerad (Figur 4) och funktioner i biofilmen kan kvantifieras med datorprogram som COMSTAT 12,13.
Totalt sett är den mest kritiska aspekten av protokollet att det är en tidskrävande process. Det är också en begränsning att cellerna behöver för att kunna växa på ett icke-fluorescerande, öppen yta. . Eftersom biofilm bildas analyseras med hjälp av ett konfokalmikroskop, djupet som kan undersökas är begränsad till några hundra mikrometer 14 Det finns ytterligare tekniska begränsningar inneboende i design: systemet inte är lämpad för hög throughput screening, som en erfaren forskare kan hantera som mest cirka 15 kanaler per försök, vilket i sin tur kan ta flera dagar att förbereda sig. Däremot kan antibiotika eller mutanter som anses relevanta för biofilmen studier initialt massa undersökas med andra metoder såsom kristallviolett fläckar innan de mest intressanta kandidaterna överförs till flödescell systemet. Locket glasskivor är mycket tunna och går lätt sönder, och försiktighet bör iakttas vid hantering av systemen. Dessutom slangen bör undersökas dagligen under körningen av ett experiment, som betydande "back-tillväxt" i inloppet rör just uppströms i flödet celler kan förekomma. Sådana föroreningar kan lösas genom att ta bort flera centimeter av silikon röret från inloppssidan av flödet celler, med steril teknik.
Figur 4 a) 4 dag gammal PAO1 -. GFP biofilm behandlades för 24h med kolistin och propidiumjodid för döda färgning (röd färg) b) 3D-presentation av en tre dagar gammal s. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa vild typ) – GFP biofilm 6 c) 3D-bild presentation av en PAO1 – GFP pila mutant (blå) med en PAO1 vildtyp YFP (gul) d) 5 dagar gamla PAO1 – GFP biofilm presenteras som ett 3D- bild E) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutant i CEN.PK bakgrunden) biofilmen färgats med Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |