I detta protokoll presenterar vi en metod för att mäta<em> Caenorhabditis elegans</em> Livslängden i 96 väl mikrotiterplattor.
Livslängd är en biologisk process regleras av flera olika genetiska vägar. En strategi för att undersöka åldrandets biologi är att studera djur som hamnen mutationer i delar av ålder-rättsliga vägar. Om dessa mutationer störa funktionen hos ålders-reglerande väg och därför förändra livslängden på hela organismen, ger de viktiga mekanistiska insikter 1-3.
En annan strategi för att utreda regleringen av livslängd är att använda små molekyler för att störa ålder-rättsliga vägar. Hittills har ett antal molekyler kända för att förlänga livslängden på olika modellorganismer och används som verktyg för att studera åldrandets biologi 4-16. Antalet identifierade molekyler hittills är litet jämfört med den genetiska "verktygen" som är tillgänglig att studera åldrandets biologi.
Caenorhabditis elegans är en av principen modeller som används för att studera åldrandet på grund av dess utmärkta genetik och kort livslängd på tre veckor. På senare tid har C.elegans framträtt som en modell organism för fenotyp baserade läkemedlet skärmar 5,7,16-20 på grund av sin ringa storlek och dess förmåga att växa i mikrotiterplattor.
Här presenterar vi ett test för att mäta C.elegans livslängden i 96 väl mikrotiterplattor. Analysen har utvecklats och använts med framgång till skärmen stora bibliotek för molekyler som sträcker C.elegans livslängd 7. Tillförlitligheten i analysen har utvärderats i flera tester: dels genom att mäta livslängd vildtyp djur växt vid olika temperaturer, för det andra genom att mäta livslängd mutanter med förändrad livslängd, för det tredje, genom att mäta förändringar i livslängd som svar på olika koncentrationer av antidepressiva Mirtazepine. Mirtazepine har tidigare visat att förlänga livslängden i C.elegans 7. Resultaten av dessa tester visar att analysen kan replikera tidigare resultat från andra analyser och är kvantitativa. Den mikroteststrips formatet gör också denna livslängd analys kompatibel med automatiserade system vätskehantering och tillåter integration i automatiserade plattformar.
Protokollet presenteras möjliggör mätning av C.elegans livslängden i 96 väl mikrotiterplattor. Som framgår av representativa resultat avsnittet replikerar den på ett tillförlitligt tidigare resultat och ger kvantitativ information. Med hjälp av denna analys har vi framgångsrikt visas över 89 tusen molekyler för deras effekt på C.elegans livslängd.
För narkotika screening, mäta livslängden i ett 96 väl mikrotiterplatta formatet har flera fördelar jämfört med den klassiska fasta medier analys. Det minskar arbete som krävs för media förberedelse, mängden inkubation utrymme, och mängden läkemedel som behövs. Den 96-bra format och mikroskopi inställning tillåter automatisering av hela analysen för hög genomströmning visningar.
Under utvecklingen av analysen flera värden för varje variabel och kombinationer av dessa testades för deras effekter på C.elegans livslängd. Dessa tester ingår olika OP50 koncentration mellan 3 till 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), olika antal maskar per brunn från 7 till 45 7 (, 10, 15, 22, 45 maskar / brunn), annan kultur volymer som sträcker sig från 40 till 150 mikroliter per brunn (40, 60, 80, 100, 120, 150 mikroliter), och förändringar i buffert sammansättning. Om matas med en Carbenicillin-resistent OP50, visade varken Carbenicillin eller amfotericin B vid koncentrationer befanns påverka C.elegans livslängd. Kontinuerlig varsam skakning av plattor, som ofta rekommenderas i C.elegans flytande kultur, hittades onödigt för små volymer som används i denna analys. Gentle skakar dock krävs om mikrotiterplattor med större brunnar som ska användas. De värden som anges i detta protokoll omsorgsfullt har valts ut baserat på statistisk jämförelse av de testade olika förhållanden.
Det mest överraskande inslag i denna analys är förmodligen det faktum att C.elegans kan hållas i 96 brunnar som är förseglade med tejp. Side-by-side jämförelser visade inte någon skillnad i livslängd för djur odlade i oförseglade tallrikar, i plattor förseglas med en plast sealer, eller i form av plattor tätas med tätningsmedel som tillåter luftväxling. I alla tre villkor, utvecklade djuren är mycket homogent från L1 till gravida vuxna inom 65 timmar och visade mycket jämförbara livslängd. Djur odlas parallellt på NGM utvecklats något snabbare, men denna skillnad var oberoende av frånvaron eller närvaron av en sealer.
Den presenterade Protokollet är baserat på levande bakterier, men kan anpassas för döda bakterier. Men i en vätska analys en enda överlevande bakterierna snabbt kan föröka sig och åter befolka kulturen. I våra händer är det enda tillförlitliga sättet att döda bakterier i den mån de kan användas för flytande kultur vid långvarig behandling av bakterier med gammastrålning.
En viktig punkt att beakta vid planeringen av en livslängd experiment är kraften för upptäckt. Beroende på storleken på effekten måste effekten av läkemedlet av intresse att testas i flera brunnar. I ett typiskt test 4 läkemedelsbehandlade och 4 brunnar kontroll, vilket ungefär motsvarar 40-50 djur varje, borde räcka för att upptäcka en 30% ökning av livslängden i mer än 95% av försöken. Ökar med 14% bara detekteras i 60% av fallen och därför kräver mer replikera brunnar.
Den mängd livslängd data som genereras av denna analys kan användas för att utveckla experiment eller stamspecifik parametriska Gompertz modeller 1. Dessa Gompertz modeller är användbara för att bestämma kraften för upptäckt och för att uppskatta antalet falska positiva och negativa för stora skärmar. Vi kontrollerade förutsägelser av dessa modeller i blind experiment och använde dem för att uppskatta antalet falskt negativa i stora skärmar (opublicerade resultat).
Sammanfattningsvis räknar vi med att den presenterade analysen kommer att vara till stor nytta för att identifiera små molekyler som utökar livslängden hos C.elegans och studera bakomliggande mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Detta protokoll utvecklades ursprungligen vid Fred Hutchinson Cancer Research Center i Seattle av Xiaolan Ye och Michael Petrascheck i laboratorium av Linda Buck. Den detaljerade versionen ovan har varit beredd att göra hela proceduren tillgängliga för samhället i stort. Vi tackar Carol Taylor, Sarah Leboeuf och Andy Tomacelli för kritiskt läsa protokollet. Detta manuskript # 2866 från The Scripps Research Institute. Den Petrascheck Lab finansieras av Novartis ADI-programmet.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone | |
FUDR | Sigma-aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water | |
Mianserin | Sigma-aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration | |
Cyproheptadine | Sigma-aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration | |
Sealing Tape | Nunc | cat# 236370 | Polyester, non-sterile | |
96 well plate | Falcon | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene | |
Nunclon flask | Nunc | cat# 178883 | used for large volumes |