Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Published: March 18, 2011 doi: 10.3791/2496
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 2Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה למדידת

Abstract

תוחלת החיים היא תהליך ביולוגי מוסדר על ידי מספר מסלולים גנטיים. אסטרטגיה אחת כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות היא ללמוד חיות הנמל מוטציות מרכיבי גיל הרגולציה המסלולים. אם מוטציות אלו לטרוד את הפונקציה של המסלול לגיל הרגולציה, ולכן לשנות את תוחלת החיים של האורגניזם כולו, הם מספקים תובנות מכניסטית חשוב 1-3.

אסטרטגיה נוספת לחקור את הרגולציה של תוחלת החיים היא להשתמש מולקולות קטנות להפריע גיל הרגולציה המסלולים. נכון להיום, מספר מולקולות ידועים להאריך את תוחלת החיים ביצורים שונים מודל משמשים ככלים ללמוד את הביולוגיה של ההזדקנות 4-16. מספר מולקולות מזוהה עד כה הוא קטן לעומת "הכלים" הגנטי הזמין מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות.

Caenorhabditis elegans היא אחד הדגמים העיקרון המשמש במחקר ההזדקנות בגלל גנטיקה מעולה שלה אורך חיים קצר של שלושה שבועות. לאחרונה, C.elegans התפתחה כאורגניזם מודל מבוסס פנוטיפ מסכי סמים 5,7,16-20 בגלל גודלו הקטן ואת יכולתה לצמוח הצלחות microtiter.

כאן אנו מציגים assay למדוד C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. Assay פותחה בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות להאריך את תוחלת החיים C.elegans 7. האמינות של assay הוערך בדיקות מרובות: ראשית, על ידי מדידת תוחלת החיים של חיות הבר סוג גדל בטמפרטורות שונות; השני, על ידי מדידת תוחלת החיים של מוטנטים עם תוחלת החיים משתנה; שלישי, על ידי מדידת השינויים תוחלת החיים בתגובה ריכוזים שונים Mirtazepine של דיכאון. Mirtazepine יש בעבר הוכח להאריך את תוחלת החיים ב C.elegans 7. התוצאות של בדיקות אלה מראים כי assay הוא מסוגל לשכפל את הממצאים הקודמים של מבחני אחרות הוא כמותי. הפורמט microtiter גם עושה את זה assay תוחלת החיים תואם למערכות אוטומטיות טיפול נוזלי מאפשר השתלבות בפלטפורמות אוטומטיות.

Protocol

סקירה: פרוטוקול מחולק לארבעה חלקים. חלק 1 מתאר כיצד להכין את החיידקים האכלה. חלק 2 מתאר כיצד להכין את תרבות תולעת. חלק 3 מתאר כיצד ציון תוחלת החיים. חלק 4 מראה כמה תוצאות מייצג, חלק 5 מתאר כיצד להכין את הפתרונות הנדרשים. ניסויים תוחלת חיים להימשך מספר שבועות כדי להשלים. לכל שלב השבוע פרוטוקול, יום, זמן של יום נכלל כדי להקל על התכנון. השלב L4 (יום 0) משמש כנקודת התייחסות בפרוטוקול כולו.

1. הכנת חיידקים האכלה

סעיף זה מתאר את ההכנה של חיידקים האכלה. ספציפית E. coli זן משמש להאכיל C.elegans נקרא OP50. לפני פרוטוקול זה, על מנת למנוע זיהום לחצות התרבות תולעת עם חיידקים אחרים, המתח OP50 נעשה Carbenicillin / אמפיצילין עמידים 21. הכן את OP50 ארבעה עד חמישה ימים מראש. כל החומרים הבאים במגע עם OP50 חייב להיות סטרילי.

יום -7: יום חמישי (שבוע 1): לחסן 5 מ"ל של שחפת המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו - 0.1 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B עם מושבה OP50 דגירה אחת מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס שייקר חיידקי.

יום -6: יום שישי (שבוע 1).

בוקר 8:30. לחסן מוקדם כדי לאפשר זמן מספיק עבור התרבות כדי להגיע לרוויה

  1. לדלל את תרבות הלילה של OP50 1:2000 ב TB 300 מ"ל המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין. דגירה תרבות שייקר חיידקי עבור 8-12 שעות ב 37 ° C עד הרוויה הוא הגיע. אין לאפשר לתרבות לגדול יותר מ -14 שעות.
  2. מעבירים את OP50 לתוך צינור סטרילי מראש משוקלל, צנטריפוגה. גלולה OP50 ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3500 סל"ד (2200 XG) בצנטריפוגה בראש הטבלה.
  3. בטל supernatant מחדש להשעות את גלולה OP50 במים סטריליים מחדש גלולה ידי צנטריפוגה. חזור על לשטוף פעמיים.
  4. לאחר לשטוף את השני, להסיר בזהירות את כל המים הנותרים. מים אין להשאיר בצינור. לשקול את הצינור צנטריפוגה המכילה את גלולה ולחסר את המשקל של הצינור צנטריפוגה ריק על מנת לקבוע את המשקל של גלולה.
  5. ביסודיות מחדש להשעות את גלולה ב-S מוחלטת בריכוז של 100 מ"ג / מ"ל. גושים לא צריך להשאיר.
  6. ריכוז OP50 100 מ"ג / מ"ל צריכה להתאים 2 x10 10 חיידקים / מ"ל. השתמש ספקטרומטר צילום כדי לקבוע את מספר החיידקים לכל מ"ל אם הקשר בין צפיפות מספר אופטי של חיידקים בכל מ"ל ידוע. במידת הצורך, להתאים את ריכוז התמיסה האכלה OP50 עד 2 x10 10 חיידקים / מ"ל.
  7. חנות OP50solution על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש תרבות התולעת.

2. הכנת תרבות תולעת סינכרוני

סעיף זה מתאר את ההכנה של התרבות תולעת. מטרתו היא ליצור אוכלוסייה בגיל סינכרוני של תולעים. כל החומרים הבאים במגע עם C.elegans לאחר הטיפול אקונומיקה בשלב 5 צריך להיות סטרילי. פלטות נשמרים 20 ° C אלא אם צוין אחרת.

יום -6: יום שישי (שבוע 1), 16:00: העברה החיות לצלחת טרי

  1. קחו יום 5-10 הישן NGM צלחת שבו רוב האוכלוסייה התולעת מורכב L1 זחלים מורעבים.
  2. לעקר מרית מתכת ידי חימום קצר אותו מעל מבער בונזן. תן לזה להתקרר. השתמש מרית מקורר לחתוך את נתחי אגר מהצלחת המכיל את התולעים מורעבים. העברה של מספר גושים אלה על 10 ס"מ טרי צלחת NGM seeded עם OP50. דגירה עבור כ. 65 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד רוב האוכלוסייה התולעת מורכב מבוגרים הרה להולדת. הזמן שלוקח את החיות L1 רעב הופכים למבוגרים הרה להולדת יכול להשתנות להתאמץ כדי זן.

-3 הימים: יום שני (שבוע 2) 10:00: הקמת האוכלוסייה סינכרוני

  1. איסוף תולעים מהצלחת 10 ס"מ על ידי שטיפה להם את צלחת עם מים סטריליים 5-10 מ"ל. מעבירים את הפתרון תולעת / מים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. לשטוף את התולעים על ידי centrifuging 2 דקות בצנטריפוגה על השולחן 1200 סל"ד (280 XG). בטל supernatant ולהוסיף 10 מ"ל מים. חזור.
  3. הסר supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של אקונומיקה מוכן טרי / NaOH פתרון (2.5 משק מ"ל אקונומיקה, 1 מ"ל 10N NaOH, 6.5 מ"ל H 2 O). דגירה במשך 5 דקות ב RT עד התולעים לפרוץ. הקפד מערבולת בעדינות מכל רגע. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה מתחת למיקרוסקופ לנתח.
  4. ברגע כל המבוגרים להתמוסס, מוסיפים 5 מ"ל של M9 חיץ כדי לנטרל את התגובה.
  5. לשטוף את הביצים שלוש פעמים עם חיץ M9 10 מ"ל ידי centrifuging 2 דקות ב 2500 סל"ד (1100 XG).
  6. לשטוף את הביצים אחת עם 10 מ"ל S-להשלים על ידי centrifuging 2 דקות ב 2500 סל"ד (1100 XG).
  7. הסר את supernatant, להוסיף 10 מ"ל S-להשלים ולהעביר את הפתרון צינור חרוטי טרי 50 מ"ל. הוסף 30 מ"ל של S-להשלים לנפח סופי של 40 מ"ל. נער בעדינות את שפופרת לילה בטמפרטורת החדר על nutator או מכשיר דומה.

יום -2: יום שלישי (שבוע 2), 12:00 בצהריים: זרעים בעלי החיים לתוך צלחות

  1. מתחת למשטח הביתור, לבדוק אם התולעים בקעו במהלך הלילה. קבע את הריכוז של תולעים פתרון S-להשלים את ידי ספירת מספר של תולעים 10 טיפות μL באמצעות היקף הניתוחים. הרוזן לפחות 10 טיפות עבור כל דגימה.
  2. Re-להשעות את התולעים בריכוז של 80-100 תולעים / mL ב-S-שלמה. הוסף Carbenicillin (מניות 100 מ"ג / מ"ל) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו amphotericin B (מניות 250 מיקרוגרם / מ"ל) לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל. תלחצו על nutator. אם מכינים כמויות גדולות יותר של תולעים, להשתמש בבקבוק 600 מ"ל nunclon עם מכסה המסנן.
  3. בשעה 02:30 להוסיף את OP50 שהוכנו חלק 1 לריכוז סופי של 6 מ"ג / מ"ל (= 1.2 x10 9 חיידקים / מ"ל). החזר את OP50 עד 4 ° C.
  4. העברת 120 μL של פתרון worm/OP50 לתוך היטב בכל צלחת 96 באר. השתמש 96 צלחות גם עם תחתית שקופה. הקפד לשמור את התולעים ההשעיה תוך pipetting.
  5. חותם את הצלחת באמצעות אוטם קלטת כדי למנוע זיהום אידוי. לנער את הצלחת על צלחת microtiter שייקר דקות 2 ו דגירה עבור 2 ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד החיות מגיעים לשלב L4.

יום 0: יום חמישי (שבוע 2) לפני הצהריים: לעקר בעלי חיים על ידי הוספת Fluorodeoxyuridine (FUDR)

  1. כדי לעקר החיות להוסיף 30 μL של פתרון 0.6 FUDR מניות מ"מ היטב כל אחד. צעד זה מביא את הנפח הסופי בכל טוב μL 150 ומפחית את הריכוז הסופי של OP50 מ mL / 6mg עד 5 מ"ג / מ"ל (1x10 9 חיידקים / מ"ל). חותם את הצלחת באמצעות חומרי איטום קלטת ולנער אותו 2-3 דקות על צלחת microtiter שייקר. אם OP50 נוספה בשעה 02:30 ביום -2, חשוב כי FUDR נוסף לפני הצהריים. חזור צלחות על 20 מעלות צלזיוס חממה

יום 1: יום שישי (שבוע 2): הוספת תרופות לתרבות

  1. עד 09:00 רוב החיות צריך להיות הרה להולדת ומכילים ביצים מספר אחד. הוסף את התרופות שלו השפעה על תוחלת החיים היא להיבדק בריכוז הרצוי. אם המסת תרופות DMSO הריכוזים הסופי של DMSO לא יעלה על 0.6%, כמו DMSO ריכוזים גבוה יותר מאשר 0.6% C.elegans לקצר את תוחלת החיים. לאחר תוספת של התרופה, לאטום את צלחות עם אוטם קלטת ולנער אותו 2-3 דקות על צלחת microtiter שייקר. חזור צלחות על 20 מעלות צלזיוס חממה
  2. הוספת תרופות יכול לפעמים להרוג כמה חיות לכל צלחת, במיוחד אם משתמשים אחרים ממס מאשר מים. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי לבדוק חיות מתות. ככלל, צריך להיות פחות מ 10 חיות מתות לכל צלחת 96 היטב. חזור צלחות על 20 מעלות צלזיוס חממה.

יום 4: יום שני (שבוע 3): חומרי איטום שנה

  1. כדי לאפשר חמצן טרי להיכנס לתרבות להסיר את אוטם, לחכות 1minute ו reseal את הצלחת. לנער את הצלחת במשך 2-3 דקות על צלחת microtiter שייקר. חזור פעם בשבוע.

יום 5: יום שלישי (שבוע 3): הוסף OP50 חדש כדי למנוע רעב

  1. הוסף 5 μL של הפתרון OP50 100 מ"ג / מ"ל ​​כי הוכן חלק 1 כל אחד 96 בארות כדי למנוע רעב.

3. ניקוד של תוחלת חיים.

סעיף זה מתאר כיצד ההישרדות של האוכלוסייה התולעת מסונכרן של חלק 2 מנוטר עד החיות מתו. כדי לשמור על בעלי חיים 96 צלחות היטב, השתמש במיקרוסקופ הפוכה עם מטרה 2x או 2.5x. הישרדות הקלטת נתונים שלוש פעמים בשבוע, יום שני, רביעי ושישי. שימוש בתנועה כדי לקבוע אם הם בעלי חיים חי או מת. אור חזק, אור כחול במיוחד, גורם החיות לזוז. אל תסיר חיות מתות מן assay. מדי פעם, בעלי חיים לא זז נקבעו מת לספור הקודמת עשוי לעבור בשלב מאוחר יותר.

  1. ביום 0, בתחילת הניסוי לספור את המספר הכולל של תולעים היטב כל אחד. הצנזור בארות המכילים יותר מ 18 בעלי חיים מניתוח כמו חיות אלה בארות לא יהיה מספיק OP50 ו יראה ההשפעות של הגבלת תזונתיים.
  2. על מנת להגדיל את הסיכוי כי בעלי החיים לנוע לנער את צלחת 96 היטב על צלחת microtiter שייקר דקות 2. לפני הספירה.
  3. בכל תאריך הספירה, שיא מושב ומספר בעלי חיים אשרמהלך כמו חיות. התנועה בתוך נוזל הוא הרבה יותר קל מאשר על התקשורת מוצק יכול להיגרם על ידי אורות חזקים. השימוש ההגדלה גבוה יותר עשוי לסייע לזהות תנועות עדינות מאוד, כמו אלה של קצה הלוע. תנועות עדינות כאלה הם לעתים קרובות התנועה היחידה שנצפתה חיים זקן מאוד.
  4. חזור צלחות על 20 מעלות צלזיוס חממה
  5. חזור על שלב 2-4 כל יומיים שלושה עד שכל החיות מתו.

4. נציג תוצאות.

סעיף זה מציג דוגמה כיצד לשמור רשומות של נתוני תוחלת החיים שנוצר על ידי assay זה נציג כמה תוצאות.

איור 1 א מציג דוגמה כיצד לתעד נתוני תוחלת החיים במהלך assay זה. גיליון Excel משמש כדי לעקוב אחר ההישרדות האוכלוסיות היטב כל אחד. עבור כל אחד טוב זה לתאם בצלחת, זן התרופה, ריכוז התרופה לבין המספר הכולל של בעלי חיים בחיים ביום 0 (X0) נרשם בתחילת הניסוי. היום הקובע, כמו גם את מספר החיים חיות מתות שלוש פעמים בשבוע על מנת לעקוב אחר ההישרדות של האוכלוסיות השונות היטב כל אחד. כדי גרף את התוצאות, לחשב את החלק היחסי של בעלי חיים בחיים עבור כל יום ואת העלילה זה כפונקציה של הזמן ימים. P-ערכים צריך להיות מחושב באמצעות חבילות סטטיסטיות כמו Stata או תוכנה דומה.

תוחלת החיים של מדיום C.elegans תלויה בטמפרטורה. 1B איור מראה כי שינויי טמפרטורה תלוי בתוחלת החיים הם לשכפל במדויק על ידי microtiter המבוסס תוחלת החיים assay 22. באופן דומה, assay צלחת microtiter מתרבה שינויים תוחלת החיים של מוטנטים דווח כי תוחלת החיים השונים בטבע N2 חיות סוג 23-24 25 (איור 1C).

Assay גם יכול לשמש כדי להצהיר הצהרות כמותי יותר. ב מתכוון Fig1D תוחלת החיים היא להתוות כפונקציה של ריכוז Mirtazepine 7. כל נקודת נתונים מייצג את תוחלת החיים הממוצעת של האוכלוסייה 7-12, כל החיים שונה גם כן. למרות מספרם של בעלי חיים לכל גם היא נמוכה יחסית (5-15 חיות) את הווריאציה גם ל-גם הוא קטן יחסית, כפי שניתן לראות מן הסורגים שגיאה.

איור 1
באיור 1. צלחת microtiter מבוסס תוחלת החיים assay במדויק מתרבה שינויים תוחלת החיים דיווח בספרות.
(א) נתוני המדגם נאספו גיליון אלקטרוני של Excel. במהלך כל תאריך הפגישה הספירה, לתאם את הבאר ואת מספר החיה מת לחיות נרשמה. בתחילת הניסוי, המספר הכולל של בעלי חיים גם בכל נקבע. (ב) עקומת ההישרדות של סוג בר (N2) בעלי חיים גדלו ב 20 ° C ו 25 ° C. (ג) הישרדות הקימורים של זנים נושאת מוטציות המשפיעות על תוחלת החיים. כל ארבעת הזנים היו assayed במקביל על 20 ° C. (ד) בתגובה עקומת מנה של Mirtazepine חיות N2 טיפול. ממוצע תוחלת החיים היא להתוות כפונקציה של ריכוז Mirtazepine. ברים שגיאה לציין את SEM של 8 בארות לכל מצב.

5. חומרים.

M9 חיץ, 1000 מ"ל

  • 6 גרם Na 2 HPO 4
  • 3 גרם KH 2 PO 4
  • 5 גרם NaCl
  • 0.25 גר 'MgSO 4 ∙ 7H 2 O
  • מוסיפים מים deionized עד 1000 מ"ל
  • דוד לחץ

חיץ Potassiumphosphate pH 6.0, 1000 מ"ל

  • 136 גרם KH 2 PO 4
  • מוסיפים מים כדי deionized 900 מ"ל
  • התאם ל-pH 6.0 עם KOH 5M
  • מוסיפים מים deionized עד 1000 מ"ל
  • דוד לחץ

עקוב אחר פתרון מתכת

  • 1.86 גרם Na 2 EDTA
  • 0.69 גר 'FeSO 4 ∙ 7H 2 O
  • 0.20 גר 'MnCl 2 ∙ 4H 2 O
  • 0.29 גר 'ZnSO 4 ∙ 7H 2 O
  • 0.016 גרם CuSO 4
  • 1000 מ"ל מים deionized
  • החיטוי ולאחסן בחושך.

S-basal בינוני, 1,000 מ"ל

  • 5.9 גרם NaCl
  • 50 מ"ל של אשלגן זרחתי 1M, 6.0 pH
  • 1000 מ"ל מים deionized
  • דוד לחץ
  • בואו הפתרון מגניב ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של כולסטרול 5 מג / מ"ל ​​(מומס Et-OH).

אשלגן ציטרט 1M, 1000 מ"ל

  • 268.8 גרם ציטראט tripotassium
  • 26.3 חומצה ציטרית monohydrate
  • מוסיפים 900 מ"ל מים deionized
  • התאם ל-pH 6.0 עם KOH 5M
  • מוסיפים מים deionized עד 1000 מ"ל
  • דוד לחץ

S-בינוני מלא, 1000 מ"ל

  • 977 מ"ל S-basal
  • 10 מ"ל אשלגן ציטרט 1M pH 6 (סטרילי)
  • 10 מ"ל מתכות פתרון מעקב (סטרילי)
  • 3 מ"ל 1M CaCl 2 (סטרילי)
  • 3 מ"ל 1M MgSO 4 (סטרילי)

NGM אגר

  • 3.0g NaCl
  • 2.5G Peptonמ (קזאין, הלבלב לעיכול)
  • 17g אגר
  • מוסיפים מים כדי deionized 975 מ"ל ובר בחישה
  • דוד לחץ
  • לאחר מעוקר להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים את המרכיבים הבאים:
    • 0.5 מ"ל של 1M CaCl 2 (סטרילי)
    • 1 מ"ל של כולסטרול 5mg / mL באתנול
    • 1 מ"ל של 1M MgSO 4 (סטרילי)
    • 25 Potassiumphosphate חיץ מ"ל, pH 6.0 (סטרילי)

TB, 1000 מ"ל

  • 12g Bacto Tryptone
  • 24 גרם תמצית שמרים
  • 4 מ"ל גליצרול
  • מוסיפים 900 מ"ל מים deionized
  • דוד לחץ
  • לאחר מעוקר להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים את המרכיב הבא:
    • מוסיפים 100 מ"ל של 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4

0.6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, סיגמא חתול # F0503), 1000 מ"ל

  • 100 מ"ג FUDR
  • ממיסים ב 670 מ"ל סטרילי S-מלא, לעשות 10 מ"ל או 45 מ"ל aliquots.
  • חנות ב -20 ° C.

100 מ"ג / מ"ל ​​Carbenicillin, 10 מ"ל

  • 1 גרם Carbenicillin
  • 10 מ"ל מים סטריליים deionized
  • תסנין ועיקור ו aliquot
  • חנות ב -20 ° C.
  • השתמש בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל

250ug / mL amphotericin B, 4 מ"ל

  • 1mg amphotericin B
  • 4 מ"ל Et-OH
  • חנות ב -20 ° C
  • השתמש בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל

Discussion

פרוטוקול שהוצג מאפשר מדידת C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. כפי שמוצג בתוצאות נציג בסעיף זה אמין משכפל ממצאים קודמים ומספק מידע כמותי. שימוש assay זה יש לנו הוקרן בהצלחה והשפעתם על תוחלת החיים C.elegans מעל 89,000 מולקולות.

לצורך ההקרנה סמים, מדידת תוחלת החיים בתבנית 96 microtiter גם צלחת יש מספר יתרונות על פני assay התקשורת הקלאסית מוצק. זה מפחית את העבודה הדרושה התקשורת הכנה, את כמות שטח הדגירה, ואת כמות התרופה הנדרשת. הפורמט 96-היטב את ההגדרה מיקרוסקופיה לאפשר אוטומציה של assay כולו הקרנות תפוקה גבוהה.

במהלך הפיתוח של assay ערכים מרובים עבור כל משתנה ושילובים של הנ"ל נבדקו השפעתם על C.elegans תוחלת החיים. בדיקות אלה כללו ריכוז OP50 שונים הנעים בין 3-10 מ"ג / מ"ל ​​(3, 4, 6, 8, 10 מ"ג / מ"ל), מספר שונה של תולעים בכל טוב החל 7-45 (7, 10, 15, 22, 45 תולעים / טוב), כרכים תרבות שונים הנעים בין 40 ל 150 לכל μL היטב (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), וכן שינויים בהרכב חיץ. אם נמאס עם OP50 Carbenicillin עמידים, ציין לא Carbenicillin ולא amphotericin B בריכוזים נמצאו להשפיע C.elegans תוחלת החיים. רעד עדין רציף של הצלחות, כמו מומלץ לעיתים קרובות בתרבות C.elegans נוזלי, נמצא לוותר על בנפחים קטנים המשמשים assay זה. רעד עדין אך נדרש אם microtiter צלחות עם בארות גדולים יותר לשמש. הערכים המצוינים בפרוטוקול זה נבחרו בקפידה על בסיס השוואה סטטיסטית של תנאים שונים שנבדקו.

התכונה המפתיעה ביותר של assay זה כנראה העובדה C.elegans יכולים להישמר 96 צלחות היטב חתומות עם הקלטת. Side-by-הצד השוואות לא גילה כל הבדל בין תוחלת החיים של חיות בתרבית unsealed צלחות, צלחות חתום עם אוטם ניילון, או צלחות חתום עם חומרי איטום המאפשרים חילופי אוויר. בכל שלושת התנאים, החיות פיתחו homogenously מאוד L1 למבוגרים הרה להולדת בתוך 65 שעות והראה תוחלת החיים דומה מאוד. בעלי חיים גדל במקביל על NGM פיתחו מעט מהר יותר, אבל ההבדל הזה היה עצמאי של היעדרות או נוכחות של אוטם.

הפרוטוקול שהוצג מבוסס על חיידקים חיים, אבל יכול להיות מותאמים עבור חיידקים מתים. עם זאת, assay נוזל חיידקים לשרוד אחד יכול להתרבות במהירות לאכלס מחדש את התרבות. בידיים שלנו, הדרך היחידה אמין כדי להרוג חיידקים עד כדי כך שהם יכולים לשמש לתרבות נוזלי על ידי טיפול ממושך של החיידקים עם קרינת גמא.

נקודה אחת חשוב לקחת בחשבון בתכנון של ניסוי תוחלת החיים הוא הכוח של גילוי. תלוי בגודל ההשפעה, ההשפעה של התרופה עניין חייבים להיבדק בבארות מרובים. ב assay טיפוסי 4 סמים מטופלים 4 בארות שליטה, המקביל בערך 40-50 חיות כל, צריך להספיק כדי לזהות עלייה של 30% בתוחלת החיים ב 95% יותר מאשר הניסויים. עליות של 14% מזוהים רק 60% מהמקרים ולכן דורשים בארות לשכפל יותר.

שפע של נתוני תוחלת החיים שנוצר על ידי assay זה עשוי לשמש לפיתוח הניסוי או זן ספציפי מודלים Gompertz מצדי 1. אלה מודלים Gompertz מועילים כדי לקבוע את הכוח של איתור כדי להעריך את מספר תוצאות חיוביות וגם שליליות שווא עבור בקנה מידה גדול המסכים. אנו לאמת את התחזיות של מודלים אלה בניסויים עיוור והשתמשו בהם כדי להעריך את מספרם של תשלילים כוזב מסכים גדולים (תוצאות לא פורסם).

לסיכום, אנו צופים כי assay הציג תהיה תועלת רבה לזהות מולקולות קטנות להאריך את תוחלת החיים של C.elegans ו ללמוד את המנגנונים.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

פרוטוקול זה פותח במקור על ידי Xiaolan יה מיכאל Petrascheck על פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן בסיאטל במעבדה של לינדה באק. הגרסה המפורטת לעיל הוכנה על מנת להפוך את התהליך כולו לרשות הציבור הרחב. אנו מודים קרול טיילור, שרה LeBoeuf ואנדי Tomacelli עבור אנושות בקריאת פרוטוקול. זהו כתב היד # 2866 מן המחקר סקריפס המכון. המעבדה Petrascheck ממומנת על ידי תוכנית נוברטיס ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Calbiochem cat# 171375 Also called Fungizone
FUDR Sigma-Aldrich cat# F0503 FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin Sigma-Aldrich M2525-250MG Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine Sigma-Aldrich cat#C6022-MG Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape Nalge Nunc international cat# 236370 Polyester, non-sterile
96 well plate Falcon BD cat# 351172 Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask Nalge Nunc international cat# 178883 used for large volumes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
  2. Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
  3. Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
  4. Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
  5. Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
  6. McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
  7. Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
  8. Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
  9. Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
  10. Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
  11. Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
  12. Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
  13. Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
  14. Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
  15. Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
  16. Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
  17. Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
  18. Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
  19. Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
  20. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  23. Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
  24. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
  25. Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).

Tags

ביולוגיה של התא גיליון 49 תפוקה גבוהה ההקרנה הזדקנות תוחלת החיים הקרנת פנוטיפ מבוסס גילוי תרופות מחלות הקשורות לגיל

Erratum

Formal Correction: Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 05/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. A constituent of the S-complete medium was omitted.

The omitted constituent was:

  • 3 ml 1M CaCl2 (sterile)
מדידת<em> Caenorhabditis elegans</em> חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solis, G. M., Petrascheck, M.… More

Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (49), e2496, doi:10.3791/2496 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter