Självhäftande micropatterns att normalisera cellulära arkitektur kan användas för att öka känsligheten i detektion av läkemedelseffekter, förbättra reproducerbarhet och förenkla automatisk bildtagning och analys. Sådan teknik kommer att gynna drog / siRNA screening analyser, som utförs på konventionella stöder cellkulturen och därmed lider av överdriven cell-till-cell variabilitet.
Hittills är de flesta HCA (High Content Analysis) studier som genomförts med tillhörande cellinjer som odlats på ett homogent substrat i vävnad-kultur behandlas mikro-plattor. Under dessa förhållanden, celler sprida och dela i alla riktningar vilket resulterar i en naturlig variabilitet i cell form, morfologi och beteende. Den höga cell till cell variansen i den totala populationen hindrar framgång HCA, särskilt för läkemedelsutveckling. Förmåga micropatterns att normalisera form och interna polaritet av varje enskild cell ger en fantastisk möjlighet för att lösa denna kritiska flaskhals 1-2.
För att underlätta tillgången och användningen av micropatterning teknik, har CYTOO utvecklat ett sortiment av färdig att använda micropatterns, finns i täckglas och brunn format. I denna video artikeln ger vi detaljerade protokoll över alla rutiner från cell seedning på CYTOOchip micropatterns, läkemedelsbehandling, fixering och infärgning till automatiserade inköp, automatiserad bildbehandling och slutlig analys av data. Med detta exempel visar vi hur micropatterns kan underlätta cellbaserade analyser. Förändringar av cellen cytoskelettet är svåra att kvantifiera i celler odlade på homogent substrat, men odling celler på micropatterns resulterar i ett reproducerbart organisation av aktin meshwork på grund av systematiska placeringen av kontakterna celladhesion i varje cell. En sådan normalisering av intracellulära arkitekturen gör kvantifiering av även små effekter på aktin cytoskelettet vilket framgår av dessa uppsättning protokoll med blebbistatin, en hämmare av aktin-myosin interaktion.
Val av micropattern
Medan effekterna av 5 mikroM blebbistatin är knappt mätbar på standard kulturen stödjer, är effektiv kvantifiering möjligt på micropatterns som koncentrerar aktin i en enda stor stress fiber. Detta ökar visualisering av aktin cytoskelettet hjälpa exakt kvantifiering av blebbistatin effekter på cellen. Valet av micropattern form är avgörande för utformningen av analysen och är utformad enligt de fenotypiska förändringar som bör lyftas fram i studien.
Slutsatser
Micropatterns underlättar visualisering och kvantifiering av läkemedelseffekter, speciellt vid låga koncentrationer. Utbyte av homogen plana underlag med lim micropatterns för cell-baserade analyser ökar noggrannheten, känsligheten och kvaliteten på uppgifter som framställts. Följaktligen är färre celler som behövs för analys för att uppnå robusta statistiska resultat 3. Självhäftande micropatterns erbjuda ett verkligt tillfälle att förbättra funktionella studier och undersöka fenotypiska förändringar vid lägre koncentrationer för att undvika att framkalla toxiska eller indirekta läkemedelseffekter. Om adekvat screening plattformar används, kan micropatterns möta kraven från läkemedelsföretag för att förbättra gen / drug screening program. Några ytterligare exempel på de senaste publikationer som har utnyttjat micropatterns för att analysera och kvantifiera cellulära fenomen som citeras nedan 3-13.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |
Cell culture | ||||
CYTOOchips 20×20 L-M-FN | CYTOO | 10-114 | CYTOOchips are available for adsorption of the protein of your choice | |
PBS 1x | Gibco | 14040-091 | ||
Counting chamber (Kova slide) | Prolabo | 71287.01 | ||
DMEM/F-12 + Glutamax-I | Gibco-Invitrogen | 25300-054 | ||
FBS (f tal bovine serum) | PAA | 31331-028 | ||
Penicillin & Streptomycin | PAA | A15-101 | ||
6 wells-plate | Dutscher | 353046 | ||
centrifuge | Fisher Scientific | M65838 | ||
Microscope | Nikon | |||
Drugs, fixation and immunostaining | ||||
Cytoskeleton Buffer 1X (CB) | Sigma | MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 |
10 mM MES pH 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA |
|
Sucrose | Sigma | S2395 | ||
PFA 32 % | Electron Microscopy Sciences | 15714 | ||
PFA 5% | Mix 10 mL of PFA 32% with 54 mL of CB 1.185X | |||
Triton-X100 | Sigma | T9284 | ||
PBS tablets | Gibco-Invitrogen | 18912-014 | ||
Bovin serum albumin (BSA) | Sigma | A7806 | ||
Phallodin-FITC | Sigma | P5282 | ||
Hoescht | Invitrogen | H3570 | ||
Blebbistatin | Euromedex | BN0640 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
NH4Cl 0.1M | Sigma | M11209 | ||
Image Acquisition | ||||
Epifluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ti | ||
CCD Camera | TBC | TBC | ||
ImageJ Software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |