ЦМТ представляет собой мощный инструмент для изучения связывания лиганда с его хозяином. В сложных системах однако, несколько моделей, может соответствовать данным одинаково хорошо. Метод, описанный здесь, предоставляет средства для выяснения соответствующей моделью привязки для сложных систем и извлечь соответствующие термодинамических параметров.
Изотермические калориметрии титрования (ЦМТ) обычно используется для определения термодинамических параметров, связанных с связывание лигандов с хостом макромолекулы. МТЦ имеет некоторые преимущества по сравнению с общим спектроскопических подходы для изучения хост / лиганд. Например, тепла, выделяемого или поглощаемого когда два компонента взаимодействуют непосредственно измеряется и не требует каких-либо экзогенных журналистам. Таким образом, обязательными энтальпии и постоянной ассоциации (Ka) непосредственно получить из данных ЦМТ, и может быть использована для расчета энтропийного вклада. Более того, форма изотермы зависит от с-стоимость и механистической модели участвуют. С-стоимость определяется как C = N [P] ТКА, где [Р] т является концентрация белка, а п-число лиганд связывающих участков в пределах хоста. Во многих случаях, множественные сайты связывания данного лиганда неэквивалентный и МТК позволяет характеристика термодинамических параметров связывания для каждого отдельного сайта связывания. Это, однако, требует, чтобы правильная модель привязки быть использованы. Этот выбор может быть проблематичным, если различные модели может поместиться в тех же экспериментальных данных. Ранее нами было показано, что эта проблема может быть преодолена путем проведения экспериментов на нескольких с-значениями. Несколько изотерм, полученных при различных с-значения подходят одновременно для отдельных моделей. Правильная модель следующего определены на основе критерия согласия во всем переменным с набором данных. Этот процесс применяется здесь, чтобы аминогликозидов сопротивление вызывающих фермента аминогликозидов N-6'-ацетилтрансферазы-II (AAC (6 ')-II). Хотя наша методология применима к любой системе, необходимость этой стратегии лучше продемонстрировал макромолекулы-лиганд система показывает allostery или кооперативности, и когда различные обязательные модели обеспечивают практически идентичны подходит для тех же данных. Насколько нам известно, Есть нет таких систем на коммерческой основе. AAC (6 ')-II, является гомо-димер, содержащий два активных центров, показывая кооперативности между двумя подразделениями. Однако ЦМТ данных, полученных на одном с-значение может быть одинаково хорошо подходит, по крайней мере две различные модели двух наборов-оф-сайты независимых модели и два сайта последовательными (кооперативные) модели. Через различные с-значение, как указывалось выше, было установлено, что правильная модель привязки для AAC (6 ')-Ii состоит из двух последовательных сайте модель привязки. Здесь мы опишем шаги, которые необходимо предпринять при выполнении ITC экспериментов с целью получения данных подходит для переменной с анализами.
Эта аналитическая часть переменной с установки был ранее подробно описаны 10. Здесь мы приводим практические аспекты сбора переменных данных с подходящим для этого подхода. Очень важно, чтобы все белка и лиганда образцы взяты из тех же растворов акций. Поэтому важно, чтобы достато…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Национальным научным и инженерным исследованиям Совета (NSERC), а также обучение CIHR предоставлять стипендии (для LF). Мы благодарим профессора Джерарда Д. Райт (McMaster University, Канада) для AAC (6)-Ii выражение плазмиды.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |