Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Samla Variable-koncentration Isotermiska Dataset Titrering Calorimetry för att fastställa bindande mekanismer

doi: 10.3791/2529 Published: April 7, 2011

Summary

ITC är ett kraftfullt verktyg för att studera bindningen av en ligand till sin värd. I komplexa system kan dock flera modeller passar data lika bra. Den metod som beskrivs här ger en möjlighet att belysa lämplig bindande modell för komplexa system och extrahera motsvarande termodynamiska parametrar.

Abstract

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) är vanligen används för att bestämma termodynamiska parametrar i samband med bindning av en ligand till en värd makromolekyl. ITC har vissa fördelar jämfört med vanliga spektroskopiska metoder för att studera värd / ligand interaktioner. Till exempel är den värme som frigörs eller absorberas när de två komponenterna samverkar direkt mätt och kräver inte någon exogen reportrar. Således bindande entalpi och föreningen konstant (Ka) är direkt från ITC data och kan användas för att beräkna entropiska bidrag. Dessutom är formen på isotermen beroende av c-värde och mekanistiska modellen inblandade. C-värde definieras som c = n [P] TKA, där [P] t är det protein koncentrationen, och n är antalet ligandbindande platser i värden. I många fall flera bindningsställen för en viss ligand är icke-likvärdiga och ITC tillåter karakteriseringen av termodynamiska bindande parametrar för varje enskild bindningsställe. Detta kräver dock att den korrekta bindande mallen användas. Detta val kan vara problematiskt om olika modeller kan passa samma experimentella data. Vi har tidigare visat att detta problem kan kringgås genom att utföra experiment på flera c-värden. De många isotermer erhålls vid olika c-värden är lämpliga samtidigt till separata modeller. Rätt modell är nästa identifieras utifrån godhet passar hela variabel c dataset. Denna process som här tillämpas på aminoglykosid-resistens vilket enzym aminoglykosid N-6'-acetyltransferas-II (AAC (6 ')-II). Även om vår metodik är tillämplig på alla system, är nödvändigheten av denna strategi bättre visats med en makromolekyl-ligand som visar allostery eller kooperativitet, och när olika bindande modeller ger i stort sett identisk passar till samma data. Så vitt vi vet, det finns inga sådana system kommersiellt tillgänglig. AAC (6 ')-II, är en homo-dimer som innehåller två aktiva webbplatser, visar kooperativitet mellan de två subenheter. Men ITC uppgifter som erhållits vid en enda C-värde kan passa lika bra till minst två olika modeller i två set-av-sajter oberoende modell och en två-site sekventiell (kooperativ) modell. Genom att variera C-värdet som anges ovan konstaterades det att rätt bindande modell för AAC (6 ')-II är en två-site sekventiella bindande mallen. Häri beskriver vi de steg som måste tas när du utför ITC experiment för att erhålla dataset som lämpar sig för rörlig-c analyser.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Förbereda stamlösningar

  1. Rena makromolekyl av intresse. (I detta fall är aminoglykosid N-6'-acetyltransferas-II (AAC6'-II), isolerade som redovisas på annat håll. 13)
  2. Förbered 4 liter dialys buffert. (I detta fall använde vi 25 mm 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES, MW 238,3 g / mol), innehållande 2 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra, MW 292,2) vid pH 7,5.)
  3. Dialyze proteinet AAC (6 ')-Ii urval (5 ml vid 400 M) som används skall dialyseras i dialys buffert (3 x 1,3 L). Den slutliga dialysvätska hålls att skölja maskinen och att späda ut prover.
  4. Filtrera sista dialys lösningen genom ett 0,45 ìm cellulosa-filter, och lagras vid 4 ° C. Kommer att kallas "löpande buffert"
  5. Filtrera protein lösningen genom ett 0,2 ìm sprutfilter som har sköljts noggrant med rinnande buffert. Mät den slutliga koncentrationen av proteinet med en vanlig analys (Bradford, Lowry, etc.) eller UV-absorption. Lagra protein för att maximera långsiktig stabilitet. (I fallet AAC (6 ')-Ii innebär detta lagring vid 4 ° C. AAC (6')-II inte behålla verksamheten efter frysning och upptining).
  6. Förbered 200μL 25 mm stamlösning av acetyl coenzym A (AcCoA, liganden, MW 809,57) genom att lösa upp 4,0 mg i löpande buffert. Frys vid -78 ° C tills den ska användas.
  7. Alla protein och prover liganden måste komma från samma bestånd lösningar för att minimera slumpmässigt urval till prov variationer i koncentration. En enda korrektionsfaktor för proteinkoncentration hela variabel c dataset justeras i analysen. 10

2. Förbereda ITC prover

  1. Späd enzymet lösning på ett c-värde på 64 med en slutlig volym på 2 ml. (I fallet AAC (6 ')-Ii, motsvarar detta 192 mikroM.)
  2. Snabbt tina ligand (AcCoA) stamlösning i isvatten.
  3. Förbered 0,5 ml av en AcCoA lösning 10 gånger mer koncentrerad sedan antalet bindningsställen på proteinet, i detta fall 4 mm, genom att späda 80 mikroliter av AcCoA stamlösning i 420 mikroliter av löpande buffert. Överför till en pipett påfyllningsröret. Snabbt tillbaka AcCoA stamlösningen till -78 ° C.
  4. Degas proteinet och lösningar i vakuum i 5 minuter vid en temperatur 1 ° C under den önskade kör temperaturen (19 ° C).

3. Ställa in sprutan 14

  1. Sätt i injektionssprutan genom sprutan innehavaren tills förmonterade spruta klämman är på samma höjd som innehavare.
  2. Mata den andra sprutan klämman över injektionsspruta tills den är ordentligt tryckt mot botten av sprutan hållaren. Dra åt klämman med den medföljande 0,050 "Ball Point Hex Drive.
  3. Placera sprutan hållaren i pipetten hållaren.
  4. Försiktigt pipetten injektorn i injektionssprutan. Se till att kolven spetsen matas direkt i hålet i sprutan. När helt insatt, skruva låskragen av sprutan hållaren i pipetten injektorn.

4. Fylla provet cellen 14

  1. Tvätta provet cell med minst 50 ml löpande buffert, och ta bort eventuella kvarvarande vätska med hjälp av en lång nål 2,5 ml-glas.
  2. Sakta drar ett minimum av 1,8 ml av protein provlösningen in i ren och torr lång nål 2,5 ml spruta. Var noga med att inte införa några bubblor.
  3. Sätt försiktigt in nålen i prov cell och försiktigt röra vid botten av cellen. Lyft spetsen något (~ 1 mm) och försiktigt injicera AAC (6 ')-II-lösning i cellen tills överflödig vätska är synlig ovanför toppen av provet cellen.
  4. Sakta Höj nålen ca 1 cm samtidigt vätska kvar i överflöd. Snabbt ut och injicera en liten mängd lösning (~ 0,25 ml) för att ta bort fastnat bubblor i provet cellen.
  5. Ta bort alla lösning svämma över. Detta uppnås genom att försiktigt dra nålen vid sidan av overflow i provet cellen. Sprutan spetsen kommer att drabba en avsats, är detta en önskan höjd för att köra lösningen. Ta bort all vätska som sitter ovanför denna linje.

5. Laddar injektionsspruta och initiera köra 14

  1. Fäst plastspruta röret lastning i påfyllningsöppningen.
  2. Sänk kolven tips till toppen av fyllningen hamnen.
  3. Placera AcCoA lösningen i pipett att fylla röret i botten av pipetten hållaren. Sprutan spetsen får inte röra vid botten av påfyllningsröret.
  4. Sakta dra in lösningen i sprutan tills en liten mängd kommer in i röret av lastning sprutan.
  5. Stäng fylla porten genom att sänka kolven spets och klicka på Stäng Fyll port. Töm och fyll på, genom att klicka på Purge-> Refill knappen, tre gånger för att avlägsna eventuella luftbubblor som kan ha fastnat under lastning.
  6. Ta bort påfyllningsröret från pipetten hållaren och torka försiktigt på sprutans topp.
  7. Ta pipett montering och försiktigt sänka sprutan i provet cellen. Gör långsamt som sprutan kan lätt böjas så stor omsorg behövs. Se till att sprutan är helt in genom att trycka ner på botten av låskragen.
  8. Ställ in önskad driftstemperatur (i detta fall 20 ° C) och välj en hänvisning makt som är något större än det maximala injektionen värmeflödet förväntas (i detta fall 20μcal/sec).
  9. Programmera önskad injektionsvolymer och förseningar. (I detta fall var 28 injektioner sysselsatta. Den första injektionen hade en volym på 2 mikroliter med en 60 s fördröjning. Alla efterföljande injektioner hade volymer av 10 mikroliter med 330 s förseningar.)

6. Efterföljande Kör

  1. I alla efterföljande körningar Upprepa steg 2-5, samtidigt som man minskar AAC (6 ')-II och AcCoA koncentrationer med en faktor 2,4,8,16 och 32.

7. Data Analysis

  1. Använd en passande förfarande som globalt passar alla isotermerna till en enda uppsättning bindande parametrar, beskrivs som tidigare 10.

8. Representativa resultat

Representativa data visas i figur 1. Formerna för isotermerna bör variera med koncentration. Skarpare övergångar väntas för högre c-värden (dvs. högre protein och koncentrationer ligand) (Figur 2).

Vid AAC (6 ')-Ii, ger två-site sekventiella modellen passar bättre än en som beskriver två uppsättningar av identiska, oberoende webbplatser med justerbar stoichiometries.

Figur 1
Figur 1. Isotermer produceras genom titrering av AcCoA (3,86 mM) till AAC (6 ')-Ii (192 M). A) obehandlad ITC spår. B) Den integrerade värden används för att fastställa bindande parametrar (torg) med en 2-plats sekventiella fit (-).

Figur 2
Figur 2. ITC isotermerna för AcCoA titreras till AAC (6 ')-II vid varierande koncentrationer. Den experimentella data (öppna ringar) var det lämpligt att en 2-set-av-webbplatser oberoende modellen (streckad magenta) och en 2-plats sekventiell modell (fast blå). Den 2-platsen sequentional modell ger klart bättre övergripande överenskommelse. De anställda Halterna var A) 6 mikroM, 0,25 mm, B) 12 mikroM, 0,25 mm, C) 24 mikroM, 0,5 mm, D) 48 mikroM, 1,0 mm, E) 96 mikroM, 1,9 mm, och F) 196 mikroM, 3,86 mm, för AAC (6 ')-Ii och AcCoA respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna analytiska delen av variabel c montering har tidigare beskrivits i detalj 10. Här rapporterar vi de praktiska aspekterna av att samla in variabla c datamängder lämplig för detta synsätt. Det är viktigt att alla proteiner och prover liganden är hämtade från samma bestånd lösningar. Därför är det viktigt att tillräckliga stamlösning är beredd initialt att fullfölja hela serien av experiment. Detta säkerställer förhållandet AAC (6 ')-Ii och AcCoA är konstant bland alla experiment, och minskar slumpmässiga variationer i koncentration på ett prov till prov basis.

I detta fall måste stor försiktighet iakttas vid hanteringen av liganden. AcCoA är kemiskt instabila i lösning, så det är viktigt att stamlösning är flytande under mycket korta tidsperioder. När rätt belopp alikvoteras från stamlösningen, skall aktien omedelbart frysas om. Om detta inte görs, då AcCoA kan försämras med tiden och halterna kommer inte att vara korrekt i senare körningar. När alikvoteras måste AcCoA prover användas omedelbart. I fråga om proteiner som är instabilt, kommer liknande försiktighetsåtgärder nödvändiga.

Detta förfarande kan enkelt ändras för att studera andra komplexa system. 10 Använda Halterna måste anpassas till bindande konstanter i det systemet. Ett brett utbud av C värden mellan ca 1 och 1000 8,10 krävs över hela datasetet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), och en CIHR utbildningsstipendium stipendium (till LF). Vi tackar Prof. Gerard D. Wright (McMaster University, Kanada) för AAC (6)-Ii uttryck plasmid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetyl c–nzyme A (AcCoA) Sigma-Aldrich A2056
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 7365-45-9
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 431788
Spectra/Por 2 Dialysis Tubing Spectrum Labs 132678
Sterile Syringe Filter (0.2 μm) VWR international 281445-477
Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) Whatman, GE Healthcare 7184-004
VP-ITC MicroCal VP-ITC Microcalorimeter used for measurements
ThermoVac MicroCal USB Thermo Vac Temperature Controlled Degassing Station

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
  2. Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
  3. Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
  4. Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
  5. Okhrimenko, O. ksana, J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
  6. Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
  7. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
  8. Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
  9. Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
  10. Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
  11. Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
  12. Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
  13. Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
  14. MicroCal. ITC Data Analysis in Origin. 7 edn, MicroCal. (2004).
Samla Variable-koncentration Isotermiska Dataset Titrering Calorimetry för att fastställa bindande mekanismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freiburger, L. A., Mittermaier, A. K., Auclair, K. Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms. J. Vis. Exp. (50), e2529, doi:10.3791/2529 (2011).More

Freiburger, L. A., Mittermaier, A. K., Auclair, K. Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms. J. Vis. Exp. (50), e2529, doi:10.3791/2529 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter