Neste artigo, descrevemos a identificação da adeno-associated virus sorotipo 3 (AAV3) como o vetor mais eficiente para alvejar células humanas de câncer de fígado.
Vetores recombinantes baseado em um parvovirus patogênico não-humanos, o vírus adeno-associado 2 (AAV2) foram desenvolvidos e estão atualmente em uso em uma série de ensaios clínicos de terapia genética. Mais recentemente, um número de sorotipos adicionais AAV também foram isolados, que foram mostrados para expor seletiva tropismo de tecido em vários modelos animais pequenos e grandes 1. Dos 10 sorotipos mais comumente usados AAV, AAV3 é de longe o menos eficiente na transdução de células e tecidos in vitro, bem como in vivo.
No entanto, em nossos estudos recentemente publicados, temos documentado que AAV3 vetores transduzir câncer de fígado humano – hepatoblastoma (HB) e carcinoma hepatocelular (HCC) – linhas de células de forma extremamente eficiente porque utiliza AAV3 receptor do fator humano como um hepatócito crescimento celular co-receptor para a ligação e entrada nestas células 2,3.
Neste artigo, descrevemos os passos necessários para atingir alta eficiência de transdução de células humanas de câncer de fígado por vetores recombinantes AAV3 carregando um gene repórter. O uso de vetores recombinantes AAV3 carregando um gene terapêutico pode eventualmente levar à terapia genética potencial de câncer de fígado em humanos.
Vetores recombinantes baseados em um parvovírus não-patogênicos humanos, o vírus adeno-associado (AAV) têm sido desenvolvidas, e estão atualmente em uso em uma série de ensaios clínicos de terapia genética 5. Anteriormente, dos 10 sorotipos mais comumente usados AAV, a eficiência de transdução de AAV3 vetores em geral, tem sido relatada a ser particularmente baixo, tanto in vitro como in vivo 1. No entanto, a nossa observação recente de que AAV3 vetores transdução do fígado humano linhas celulares de cancro muito bem, conforme determinado quantitativamente por citometria de fluxo 2, e que o ser humano utiliza AAV3 hepatócito receptor do fator de crescimento (hHGFR) como um co-receptor celular para a entrada obrigatória e nestes 3 células, sugerem fortemente uma seletiva do tecido tropismo de AAV3 de células do fígado humano em geral, e as células humanas de câncer de fígado em particular. No entanto, desde AAV3 vetores também transdução de hepatócitos humanos normais de forma eficiente 2, seu uso potencial no câncer de aplicação da terapia gênica in vivo seria impactado negativamente. Uma possível estratégia para contornar esse problema em potencial envolve a transcrição de metas de células de câncer através da identificação de um produto gene que é seletivamente produzida pelo tumor, mas não pelos hepatócitos normal. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que os níveis séricos de α-fetoproteína (AFP) são usados como um marcador específico para o rastreamento da presença, progressão e / ou a recorrência de certos tipos de cânceres de fígado, uma vez que os hepatócitos normais geralmente produzem quantidades muito pequenas de esta proteína. Na verdade, temos utilizado AAV3 vetores contendo o promotor AFP para atingir a expressão do transgene em células de câncer de fígado, mas não em hepatócitos normais 2, e os estudos estão em andamento para testar a eficácia desta abordagem em um modelo murino xenoenxerto de câncer de fígado. Em nossos estudos adicionais, temos observado que a eficiência de transdução de vetores sorotipo vários AAV pode ser significativamente aumentada pelo sítio-dirigida mutagênese da superfície exposta resíduos de tirosina na capsídeos virais 14/06. Desde 6 de 7 de superfície exposta tirosinas também são conservados em AAV3, temos realizado mutagênese sítio-dirigida desses resíduos e observaram que a eficiência de transdução de tirosina-mutante AAV3 vetores é significativamente maior em células de fígado humano com câncer (dados não publicados). Estudos também estão em andamento para avaliar a segurança ea eficácia da tirosina-mutante AAV3 vetores em modelos xenoenxerto mouse para hepatoblastoma humanos e carcinoma hepatocelular, e se bem sucedida, o ideal tirosina-mutante vetores sorotipo AAV3 pode vir a ser útil para a segmentação do fígado humano câncer para a terapia genética potencial.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a drs. R. Jude Samulski e Xiao Xiao para os presentes o seu tipo de AAV3 recombinante e AAV-EGFP plasmídeos, respectivamente, e Gail Dr. Tomlinson para generosamente fornecimento de células Hep293TT. Esta pesquisa foi suportada em parte pelo Serviço de Saúde Pública conceder bolsas R01 HL-076901, R01 HL-097088, e P01 DK-058327 (Projeto 1) do National Institutes of Health (para AS).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
PEI | Polysciences | 23966 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |