I denna artikel beskriver vi identifieringen av Adeno-associerad serotyp 3 (AAV3) som den mest effektiva vektorn för inriktning mänskliga celler levercancer.
Rekombinanta vektorer baserade på ett icke-patogena mänskliga Parvovirus har Adeno-associerade virus 2 (AAV2) utvecklats och används för närvarande i ett antal kliniska genterapi försök. På senare tid har ett antal ytterligare AAV serotyper även isolerats, som har visat att ställa ut selektivt vävnad-tropism hos olika små och stora djurmodeller 1. Av de 10 vanligaste AAV serotyper är AAV3 i särklass minst effektiva i transducing celler och vävnader in vitro och in vivo.
Men i våra nyligen publicerade studier har vi dokumenterat att AAV3 vektorer transduce mänskliga levercancer – hepatoblastoma (HB) och hepatocellulär cancer (HCC) – cellinjer extremt effektivt eftersom AAV3 använder mänskliga hepatocyte receptor tillväxtfaktor som en cellulär co-receptor för bindning och införande i dessa celler 2,3.
I denna artikel beskriver vi de åtgärder som krävs för att uppnå hög effektivitet transduktion av mänskliga celler levercancer med hjälp av rekombinant AAV3 vektorer som bär en reporter gen. Användning av rekombinanta AAV3 vektorer som bär en terapeutisk gen kan så småningom leda till att potentiella genterapi av lever cancer hos människor.
Rekombinanta vektorer baserade på ett icke-patogena mänskliga parvovirus, den Adeno-associerade virus (AAV) har utvecklats, och används för närvarande i ett antal genterapi kliniska prövningar 5. Tidigare av de 10 vanligaste AAV serotyper har transduktion effektivitet AAV3 vektorer i allmänhet rapporterats vara särskilt låg, både in vitro och in vivo 1. Men vår senaste observationen att AAV3 vektorer transduce mänskliga levercancer cellinjer utomordentligt väl, som bestäms kvantitativt genom flödescytometri 2 och att AAV3 utnyttjar den mänskliga hepatocyte receptorn growth factor (hHGFR) som en cellulär co-receptor för bindande och inträde i dessa celler 3, rekommenderar starkt ett selektivt vävnad-tropism för AAV3 för mänskliga leverceller i allmänhet, och mänskliga leverceller cancer i synnerhet. Men eftersom AAV3 vektorer även transduce normala humana hepatocyter effektivt 2, skulle deras potentiella användning i cancer genterapi ansökan in vivo påverkas negativt. En möjlig strategi för att kringgå detta potentiella problem handlar transkriptionell inriktning av cancerceller genom att identifiera en gen produkt som selektivt produceras av tumören, men inte av normala hepatocyter. Till exempel har tidigare studier visat att serumnivåerna av α-fetoprotein (AFP) används som en specifik markör för att spåra förekomsten, progression, och / eller återfall av vissa typer av lever-cancer, eftersom normala hepatocyter allmänhet producerar mycket små mängder av detta protein. Vi har faktiskt använt AAV3 vektorer som innehåller AFP initiativtagaren till målet transgenen uttryck i celler levercancer, men inte i normala hepatocyter 2, och studier pågår för att testa effekten av detta synsätt i en murin xenograft modell av levercancer. I våra ytterligare studier har vi konstaterat att det transduktion effektiviteten i olika AAV serotyp vektorer väsentligt kan utökas genom sajt riktad mutagenes av yta exponerad tyrosin rester i den virala capsids 6-14. Eftersom 6 av 7 yta exponerad tyrosines finns också bevarade i AAV3 har vi utfört site-directed mutagenes dessa restprodukter och konstaterade att transduktion effektivitet tyrosin-mutant AAV3 vektorer avsevärt förbättras i mänskliga celler levercancer (opublicerade data). Studier är också närvarande för att utvärdera säkerhet och effekt av tyrosin-mutant AAV3 vektorer i modeller mus xenograft för mänskliga hepatoblastoma och levercancer, och om det lyckas, kan den optimala tyrosin-mutant AAV3 serotyp vektorer visa sig vara användbara för att rikta människor lever cancer för potentiella genterapi.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. R. Jude Samulski och Xiao Xiao för deras vänliga gåvor av rekombinant AAV3 och AAV-EGFP plasmider, respektive, och Dr Gail Tomlinson för generöst att ge Hep293TT celler. Denna forskning stöds delvis av Public Health Service bevilja bidrag R01 HL-076.901, R01 HL-097.088, och P01 DK-058.327 (Projekt 1) från National Institutes of Health (AS).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
PEI | Polysciences | 23966 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |