mStrawberry OP9 cellule permettere una valutazione completa di tutte le ES-derivati dalla progenie di co-coltura.
La differenziazione in vitro di cellule staminali verso un destino di cellule ematopoietiche è utile quando si studiano popolazioni di cellule che sono di difficile accesso in vivo e per caratterizzare i primi geni coinvolti nella ematopoiesi, senza avere a che fare con lethalities embrionale. Il ES/OP9 co-coltura sistema è stato originariamente progettato per produrre progenie ematopoietiche, senza la produzione su dei macrofagi, come il OP9 linea di cellule stromali deriva dal calvaria di topi mutanti privi di osteopetrosi funzionale M-CSF. In vitro ES/OP9 co-coltura sistema può essere utilizzato al fine di ricapitolare primo sviluppo ematopoietiche. Quando OP9 coltivati su cellule stromali, cellule staminali si differenziano in Flk-1 + emangioblasti, progenitori emopoietici, e finalmente maturo, lignaggi terminalmente differenziate. Lo standard ES/OP9 co-coltura protocollo prevede l'inserimento di cellule staminali embrionali su uno strato confluente di OP9 cellule, così come, a pochi passi replating periodici al fine di rimuovere vecchi, contaminando OP9 cellule. Inoltre, i protocolli attuali coinvolgono valutare solo le cellule ematopoietiche si trovano in sospensione e non sono ottimizzati per la valutazione di ES-derivati della progenie per ogni giorno di differenziazione. Tuttavia, con passi replating e la raccolta di cellule in sospensione una sola manca potenzialmente una grande porzione di ES-derivati progenie e lo sviluppo di cellule ematopoietiche. Questo problema diventa importante affrontare quando si cerca di caratterizzare i difetti ematopoietiche associati a linee ES eliminazione diretta. Qui si descrive una versione modificata ES / mStrawberry OP9 co-coltura, che consente l'eliminazione dei contaminanti OP9 cellule di test a valle. Questo metodo permette la valutazione completa di tutti gli ES-derivati della progenie per tutti i giorni di co-cultura, risultando in un modello di differenziazione ematopoietiche, che più direttamente corrisponde al modello di differenziazione ematopoietiche osservate entro l'embrione.
Corretta differenziazione delle cellule ES sullo strato confluenti di cellule mStrawberry OP9 risultati nella produzione di Flk1 emangioblasti + al 5 ° giorno di co-coltura. Emangioblasti dovrebbe apparire come ammucchiate spirali di cellule, come osservato in Figura 1. Per il resto della co-coltura, visibile ES-derivati progenie dovrebbe apparire come ammassi di cellule ematopoietiche (Figura 1). Al 6 ° giorno / 7 03:58 ammassi cellulari dovrebbe comparire e crescere in cluster cella più grande (sia aderenti e in sospensione) entro il giorno 8 / 9 della co-coltura. Progenie ES altri derivati si trovano anche strettamente legati all'interno dello strato aderente cellule stromali.
Anche se non elencati nel protocollo, è fondamentale pre-test del FBS utilizzare nel supporto della crescita ES, la mStrawberry OP9 terreni di coltura e la ES / mStrawberry OP9 mezzi differenziazione. Adeguatamente testati siero dovrebbe garantire la corretta crescita di mStrawberry OP9 cellule, così come, proprio la differenziazione delle cellule ES in co-coltura fino a 5 ° giorno di differenziazione. In alternativa o in aggiunta al mStrawberry OP9 cellule, OP9 cellule possono essere irradiati, a 8000 rad, prima della semina a confluenza (7.8×10 4 celle / cm 2). Irradiazione di cellule OP9 permette l'eliminazione delle ripetute fasi replating, nonché, permette l'eliminazione quasi totale della vecchia, contaminando OP9 cellule di test a valle.
OP9 cellule sono state progettate per esprimere la proteina mStrawberry di trasduzione OP9 cellule con 3ug/mL di un mStrawberry vettori lentivirali che esprimono sotto il controllo di un promotore CMV (pRRLsin-CMV vettore, UCLA vettore core).
Standard ES/OP9 co-coltura protocolli comportano il collocamento di cellule staminali embrionali su un confluenti strato OP9 cellule, così come, a 5 passo replating giorno per ridurre vecchio, contaminando OP9 cellule dal passaggio delle cellule. Inoltre, solo le cellule ematopoietiche si trovano in sospensione vengono rimossi per la valutazione di ES-derivati progenie. Tuttavia, sia con un passo replating e la raccolta di cellule in sospensione una sola manca potenzialmente un numero considerevole di sviluppo ES-derivato cellule ematopoietiche. Questo problema diventa importante affrontare quando si cerca di caratterizzare i difetti ematopoietiche associati a linee ES eliminazione diretta. Per aggirare questo problema il nostro laboratorio utilizzato una versione modificata di co-cultura, attraverso l'utilizzo di mStrawberry che esprimono OP9 cellule. Questo assicura che tutte le progenie ES sono trasferite al continuo co-cultura al giorno 5, e per la raccolta di tutte le ES-derivati progenie per saggi a valle. Questa modifica fornisce strumenti utili nella valutazione e caratterizzazione di progenie ematopoietiche derivate da entrambe le ES umane e delle linee del mouse.
Questo ES-mStrawberry OP9 co-coltura modello ricapitola le varie fasi primitive e ematopoiesi definitiva. Nello studiare le prime fasi di sviluppo ematopoietici, molte persone utilizzano la batteria BL-CFC (Blast-come cellule formanti colonie) test, che valutano lo sviluppo del hemangioblast dalle cellule staminali. Mentre il modello BL-CFC saggio è uno strumento utile nell'ambito delle indagini primi stadi dello sviluppo ematopoietico, il mStrawberry-ES co-coltura sistemi mostre utilità aumentare in quanto consente per la valutazione delle hemangioblast, così come, linee ematopoietiche più adulto.
Il lavoro precedente con OP9/ES tradizionali e protocolli differenziazione EB ha dimostrato che altri fattori forse necessario, come l'iperespressione di HoxB4, al fine di ricavare lungo termine ripopolare le cellule staminali ematopoietiche in vitro. Lavoro supplementare è necessario valutare se mStrawberry negativo, in ordine ES-derivati popolazioni contengono vere cellule staminali ematopoietiche.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo U. Ganapati per la creazione e il collaudo dei mStrawberry OP9 linea cellulare. Inoltre, ringraziamo H. Shafifor suo aiuto con la co-coltura. HP è supportato da una borsa di studio presso l'Istituto National Heart, Lung, and Blood (F31HL087714) (HP). Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto National Heart, Lung, and Blood o il National Institutes of Health (NIH). Il meccanismo di Citometria a flusso UCLA Core è supportato dal NIH (CA-16042-28697 e AI), la Jonsson Cancer Center, la UCLA AIDS Institute, e la UCLA School of Medicine.
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 |