FRAP ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) टैग संवर्धित कोशिकाओं में प्रोटीन की गतिशीलता यों इस्तेमाल किया गया है. हम photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली प्रतिशत का विश्लेषण करके GFP के मोबाइल / स्थिर भिन्न जांच की. इस अध्ययन में, FRAP hippocampal न्यूरॉन्स के spines में प्रदर्शन किया गया था.
FRAP GFP टैग प्रोटीन की गतिशीलता यों इस्तेमाल किया गया है. एक मजबूत उत्तेजना लेजर का प्रयोग, एक प्रोटीन GFP टैग के हित के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति प्रक्षालित है. क्षेत्र के प्रतिदीप्ति ठीक है जब क्षेत्र के बाहर से सख़्त प्रोटीन GFP टैग हित के क्षेत्र में diffuses. प्रोटीन की गतिशीलता तो प्रतिदीप्ति वसूली दर को मापने के द्वारा विश्लेषण किया है. इस तकनीक के लिए प्रोटीन की गतिशीलता और कारोबार दर विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस अध्ययन में, हम (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स में EGFP वेक्टर व्यक्त करते हैं. Zeiss 710 confocal खुर्दबीन का उपयोग करना, हम एक एकल रीढ़ की हड्डी में GFP प्रोटीन के प्रतिदीप्ति संकेत photobleach, और फिर समय चूक चित्र लेने के लिए प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching रिकॉर्ड. अंत में, हम इमेजिंग ImageJ और Graphpad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करके कांटा में GFP के मोबाइल और स्थिर भिन्न के प्रतिशत का अनुमान है.
यह FRAP प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे एक बुनियादी FRAP प्रयोग प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैसे डेटा का विश्लेषण करने के लिए.
FRAP विश्लेषण मोटे तौर पर दिया गया है और इन विट्रो 1-2 अध्ययन में vivo में प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक सामान्यतः GFP इस्तेमाल संलयन प्रोटीन , हालांकि यह भी लाल alga की संलयन 3 प्रोटीन का इस्तेमाल कर सकते हैं . इस विश्लेषण के प्रति संवेदनशील है और GFP टैग प्रोटीन की गतिशीलता विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है.
सार्थक FRAP विश्लेषण का उत्पादन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के पहले और FRAP प्रयोग के दौरान अनावश्यक photobleaching से बचने के लिए. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए वहाँ दो तरीके हैं. सबसे पहले, खोज और प्रयोगात्मक न्यूरॉन निरीक्षण की प्रक्रिया तेजी से होना चाहिए. विशेष रूप से, एक लंबे समय के लिए एक 100X उद्देश्य से न्यूरॉन्स का अवलोकन काफी प्रतिदीप्ति bleaches. दूसरा, उच्च लेजर शक्ति और लगातार स्कैनिंग अक्सर photobleaching की संभावना में वृद्धि. इस प्रकार, यह एक नियंत्रण क्षेत्र में photobleaching दर की गणना और फिर FRAP सामान्य वक्र क्षेत्र में प्रयोगात्मक आवश्यक हो जाएगा. सामान्य विधि प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है (विवरण के लिए 3.3-3.5 कदम देखें).
photobleaching कदम भी अच्छा FRAP परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रयोग में, हम 100% लेजर ट्रांसमिशन में 10 बार ब्याज की रीढ़ ब्लीच. इस हालत एक निश्चित तैयारी में पृष्ठभूमि स्तर के लिए एक रीढ़ की प्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए पर्याप्त है. इस प्रकार, हम photobleaching के बाद 0 सेकंड में पृष्ठभूमि के रूप में एक ही नंबर के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता सेट. प्रथम स्कैन की गति पर निर्भर करता है, प्रतिदीप्ति वसूली का एक महत्वपूर्ण राशि पहले से ही पता चला जब ब्याज की प्रोटीन अत्यधिक मोबाइल हो सकता है.
कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन जांच FRAP के साथ प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है, photoactivatable GFP (पीए GFP), या photoconvertible वेरिएंट का उपयोग. FRAP तकनीक के साथ साथ में, इन उपकरणों जीना सेल इमेजिंग अध्ययन 4-6 के लिए अपरिहार्य होते जा रहे हैं .
The authors have nothing to disclose.
यह काम बहरापन और अन्य संचार विकार पर राष्ट्रीय संस्थान (NIDCD) अंदर प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |