Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר כיצד דגימות ביולוגיות, כמו רקמת המוח, ניתן הדמיה בשלושה ממדים באמצעות אלומת יונים ממוקדת / סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (FIB / SEM). הדגימות הם קבועים עם מוכתם, אלדהידים מתכות כבדות באמצעות tetroxide אוסמיום ו אצטט uranyl. הם מיובש אז עם אלכוהול הסתננו עם שרף, שהוא מוקשה אז. באמצעות מיקרוסקופ אור ultramicrotome בסכינים זכוכית, בלוק קטן המכיל את הריבית באזור קרוב לפני השטח הוא עשה. הבלוק ממוקם אז בתוך FIB / SEM, ואת אלומת יונים בעבר טחנת בערך פנים אנכי לאורך צד אחד של הרחוב, קרוב לאזור זה. שימוש אלקטרונים backscattered לתמונה מבנים הבסיסית, פנים קטנות מחורץ אז עם אלומת יונים עדינה השטח בחנו מקרוב יותר כדי לקבוע את האזור המדויק של פני להיות צילמו ו מחורץ. הפרמטרים של המיקרוסקופ נקבעים אז כך את פניו מחורץ שוב ושוב צילמו כך שהתמונות סדרתי נאספים דרך בהיקף של הבלוק. מחסנית התמונה תהיה בדרך כלל מכילים voxels איזוטרופיים עם ממדים קטנים כמו ננומטר 4 לכל כיוון. זו איכות התמונה במישור כלשהו הדמיה מאפשרת למשתמש לנתח ultrastructure תא בכל זווית צפייה בתוך ערימה של התמונה.
Protocol
1. לדוגמה קיבוע והטבעה שרף
- דוגמאות של רקמות ותאים טרי קבועים לפחות 2 שעות paraformaldehyde 2% ו -2.5% glutaraldehyde במאגר M 0.1 פוספט ב-pH של 7.4. גודל המדגם לא יעלה על 0.150 מ"מ עובי על מנת לאפשר חדירה מקבע נאותה או, ולא צריך להשאיר לתקן את יותר מ 12 שעות.
- מניחים את דגימות צלוחיות זכוכית scintillation 20ml ולשטוף אותם שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר cacodylate 0.1M.
- הכתם עם 1.5% (w / v) אוסמיום אשלגן tetroxide פרוציאני ו 1% (w / v) במאגר cacodylate 0.1 M (0.1 מ ', pH 7.4) במשך 30 דקות.
- הכתם עם tetroxide אוסמיום 1.0% (w / v) במאגר cacodylate 0.1M 30 דקות.
- יש לשטוף מיד עם מים מזוקקים כפול 3 דקות.
- הכתם עם 1% (w / v) אצטט uranyl במים מזוקקים כפול במשך 30 דקות.
- יש לשטוף את החלקים במשך 5 דקות במים מזוקקים כפול, ולאחר מכן מייבשים בסדרה אלכוהול ציון, 2 דקות כל שינוי (1 x 50%, 1 x 70%, 1% 90 x, 1% 95 x, 2 x 100%).
- הטמע בריכוזים הגוברת של שרף Durcupan מעורבב עם אתנול, 30 דקות כל שינוי, החל Durcupan 50% אתנול, לאחר מכן על ידי: 70%, 90%, 95%, ולאחר מכן 100%.
- החלף Durcupan טריים להתסיס לאט במשך 4 שעות.
- סעיפים מקום, באמצעות מקלות עץ קוקטייל, על מיקרוסקופים שקופיות הזכוכית מצופה סוכן עובש הפרדה, ומכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. הכנת המדגם עבור FIB / SEM
- הפרד את שכבת שרף, המכיל את הדגימות, החל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולשטוף ביסודיות כדי להסיר עובש הפרדת סוכן.
- באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר עם מטרות צריכת חשמל נמוכה, או לנתח מיקרוסקופ עם תאורה לשדר, כדי לזהות את האזור של עניין בתוך פרוסה של שרף.
- גזור קטן (3 מ"מ x 3 מ"מ) מרובע סביב האזור של עניין באמצעות סכין גילוח מקל זו לראש לחסום שרף ריק עם דבק אקרילי (איור 1). המתן 5 דקות הדבק להתקשות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא.
- הצמד את הבלוק לתוך בעל ulramicrotome ו, באמצעות stereomicroscope המצורפת, מטופח סביב האזור של עניין עם סכין גילוח עד פירמידה קטנה בלבד של חומר נשאר.
- יתר על כן לקצץ את הבלוק, בעזרת סכין זכוכית קבוע לתוך ultramicrotome, כך האזור של עניין יכול להיות ממוקם בדיוק ביחס ממדים של פני השטח של בלוק (איור 1). חותכים קצה אחד של הרחוב, קרוב לאזור של עניין, כך צעד בניצב היא לחתוך המדגם (איור 1 ו - 2). צעד זה מהווה את הפנים הדמיה (איור 2).
- הסר את הבלוק מן ultramicrotome ולצלם את האזור של עניין בתוך הבלוק, באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר.
- חותכים את גוש גזוז הרחק בדל שרף הנותרים. הדבר נעשה באמצעות ראתה של צורף ומבטיח כי רק גוש קטן ממוקם בתוך FIB / SEM. הגובה הכולל של גוש זה לא צריך להיות יותר מ 5 מ"מ.
- דבק לחסום את בדל אלומיניום עם הדבק פחמן להבטיח שהצד להיות צילמו נמצא בקצה החיצוני (איור 1).
- לאחר הדבק התייבש, המעיל לחסום בשכבה דקה של זהב (> 20 ננומטר, אידוי Cressington שואב אבק).
3. הדמיה של FIB / SEM
- בהגדלה נמוכה, ושימוש משני אלקטרונים הדמיה (5 kV, 0.5 nAmp), המזרח לחסום כך את האזור שנבחר עניין הצד של הבלוק להיות צילמו עומדת בפני המפעיל (איור 2 ג, ד).
- המזרח לחסום כך את פני להיות צילמו שקרים במקביל הקורה כרסום. זאת אומרת כי אלומת אלקטרונים מכוונת על 54 ° להתמודד עם זה (2 ב איור).
- באמצעות אלומת יונים הנוכחי של 13-27 nAmps ב kV 30 להסיר רצועה צרה של שרף מהחזית האזור להיות צילמו.
- מעבר למצב הדמיה backscattered להציג את הפנים הסתובבו כי overlies האזור של עניין.
- שימוש במיקרוסקופ אור התייחסות תמונה (נלקחה ב שלב 16) ואת התמונה של הפנים הסתובבו לאתר את האזור המדויק ברחוב להיות הסתובבו וצילמו (איור 2).
- הפקדה שכבת מגן (כ 1 מיקרון עבה) של פחמן (או מתכת), באמצעות מערכת הזרקת דלק של המיקרוסקופ, על פני השטח של הבלוק, מעל האזור של עניין (איור 2).
- השימוש הנוכחי של 700 picoAmps, טחנה עד דק את האזור של גוש שבתוכו תמונות הסופי יילקחו.
- השאר את קרן כרסום לטחנת לחלוטין את הפנים בתמונה עד אין ממצאים כרסום ניתן לראות על הפנים. מפעל שלם של הפנים נבדק על ידי התבוננות שינויים כל תמונה שלאחר מכן על פני השדה כולו מבט. כרסום לקוי ניתן לראות גם פסים לבנים או "וילונות" המופיע vertically בתמונה.
- השאירו את המיקרוסקופ במשך 2 שעות לפחות עבור כל שינוי תרמית להתפוגג. פעולה זו מפחיתה את הסיכון כי הפנים לחסום ייסחף במהלך הדמיה, וכתוצאה מכך תמונות misaligned.
- בחר את הפרמטרים מיקרוסקופ הדמיה פני סדרתי. ודא כי אלומת אלקטרונים יש מתח כי היא נמוכה מספיק כדי תמונה רק בעומק רדוד מאוד של חומר מול לחסום. זה צריך להיות גם הרבה יותר רדוד יותר בעובי של הפנים כדי להסירו. פרמטרים אופייניים הדמיה הם מתח של בין 1.2-2.0 kV עם גודל פיקסל של בין 4-20 ננומטר. פיקסל לשכון זקוק לזמן כדי להיות כל הזמן סביב 10 μsecs כך את סך כל הזמן אל טחנת הקמח פנים לרכוש תמונה אחת נשמרת מתחת ל -2 דקות (איור 3).
4. סודות להצלחה
שלב 1) ודא דוגמאות אינן יותר עבה 150 מיקרון. זה יאפשר חדירה נאותה של כתמים שונים שרף לתוך החומר. זו יכולה להיות מושגת על ידי חתך את דגימות עם vibratome מיד לאחר קיבעון. עובי זה מתאים ברקמת המוח. רקמות אחרות צריכים להיבדק על מנת להבטיח קיבוע מכתים נאותים.
שלב 3) דגימות חייב להיות מופץ בחופשיות ברחבי פתרון, ולא בכבדות יחד בחלק אחד של הבקבוקון בעוד זה מקבע המשני הוא הציג. פעולה זו תבטיח חדירה מקסימלית של המדגם ולהפחית את המדגם נעשה מעוות במהלך תהליך זה קיבעון. זו מושגת על ידי בעדינות מתערבל דגימות בתוך הבקבוקון מיד אחרי הפתרון הוא הוסיף.
שלב 15) ודא כי האזור של עניין נמצא מיד מתחת (<30 מיקרון) את פני השטח של הבלוק. זה יקטין את כמות הטחינה על ידי יון הקורה בשלב רכישת התמונה.
שלב 22) בפעם סריקה של יון הקורה צריך להיות adequte כדי להבטיח את פני הדמיה כולו מחורץ לגמרי. כרסום לקוי יוצגו כמו פסים לבנים, או "וילונות" המופיע אנכית כלפי מטה מול הדמיה.
שלב 26) הפנים הסתובבו הסופי חייב להיות גדול יותר מאשר הפנים כי הוא הדמיה. הסיבה לכך היא שרף הסתובבו הוא נפלט מן הבלוק redeposits על פני השטח לחסום בסביבה הקרובה. Redeposition זה יכול לפלוש למגרש הדמיה של נוף, והוא להימנע על ידי כרסום שטח גדול הרבה יותר מאשר היא הדמיה. עבור חלון הדמיה כי הוא 20 מיקרון רחב, הפנים לחסום הסתובבו גדול מ 30 מיקרון רחב.
שלב 29) זה קריטי, כי הפרמטרים אלומת אלקטרונים הן כאלה התמונה נוצרת על ידי אלקטרונים העולות רק את ננומטר הראשונים של פני השטח של בלוק. זה acheved ידי מזעור מתח kV להלן 2 ולהבטיח כי האלקטרונים לא לחדור עמוק מדי. זה עזר גם באמצעות מתח רשת על הגלאי כך שרק אלקטרונים עם האנרגיות הגבוהות ביותר לתרום התמונה הסופית. בדרך כלל, מתח רשת של kV 1.3 משמש מתח הדמיה של 1.5 kV.
5. נציג תוצאות:
באיור 1. הכנת לחסום שרף. שרף) מוטבע סעיף העטרה (80 מיקרון עבה) דרך המוח עכברוש מבוגר שנצפו ב steromicroscope. התמונה מראה בבירור את אזורי מוח שונים שניתן לחתוך מהחלק (ב) באמצעות להב סכין המנתחים. כאן, בכיכר 1 מ"מ מהקורטקס מוסר (ג) תקוע לחסום שרף ריק. ד) לחסום שרף חיתוך אז עם סכין זכוכית רכוב ultramicrotome, וברגע לחסום צומצמה רק להשאיר את האזור של עניין (ה), צעד הוא חתך בניצב לפני השטח הקדמי של החומר מוטבע. ו) זה האזור מטופח כולו ואז לחתוך מיתר שרף ועלה על בדל אלומיניום מוכן ציפוי מתכת הדמיה ב סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
איור 2. הכנת הפנים לחסום עבור FIB / SEM הדמיה. א) ו ב) להראות איורים של הגוש ואת קצה מחורץ כדי ליצור את הפנים הדמיה (מסומן עם החץ בעל שני ראשים שחורים). העמדה של אלומת יונים (לבן) מוצג במקביל מול הדמיה, לבין אלומת אלקטרונים (אפור) מוצג להכות את הפנים על 54 ° עד יון הקורה. ג) מראה תצוגה של גוש שצולמו עם אלומת אלקטרונים הדמיה עם אלקטרונים משניים. יחד בצד הזה של לחסום את אזור כהה יותר (מסומן עם תיבת לבן מנוקד) מראה חלק של הפנים כי כבר הסתובבו בערך (מוצג פעמיים עם ראשעורך חץ שחור) כדי לחשוף את מדגם הבסיס. ד) כאשר אזור זה הוא צילמו רק באמצעות האלקטרונים backscattered רקמת מוטבע ניתן לראות. כאן, רוחב המלא של הסעיף רקמות מוטבע מסומן בחץ כפול לבן בראשותו. בר סולם ב ג) הוא 100 מיקרון.
איור 3. הדמיה נפח של רקמת המוח עם voxels איזוטרופיים.) הפוך לעומת backscattered תמונה של הפנים לחסום מראה את ultrastructure בתוך אזור במוח חולדה. ממברנות כל נראים כמו גם מבנים macromolecular גדול. ב) סך של 1600 תמונות שנאספו על המרווח 5 ננומטר וכתוצאה מכך מחסנית תמונה עם voxels איזוטרופיים. ג) מערך זה ניתן הדמיה במישור כלשהו עם רזולוציה זהה. תמונה זו מראה קשר סינפטי יחיד הדמיה במישור xy לבין מטוס YZ.
Discussion
הטכניקה של FIB / SEM הפועלת בצורה אופטימלית כאשר אזור של אינטרס אינו גדול מדי. גבול עליון נפח צילמו תלוי יון הקורה ואת השטח שהוא יכול בעקביות טחנת שוב ושוב במשך שעות רבות. עד כה זה נעשה עם האזורים של סביב 60 x 60 מיקרון, עם זאת, הדמיה זו האזור כולו אינו אפשרי עם רזולוציה תמונה מתאימה, בעיקר בשל גורם הזמן באיסוף כגון תמונה גדולה. כדוגמה, תמונה 4 KX 4 k עם פיקסל להתעכב זמן 10 מיקרו ייקח 2 דקות ו 40 שניות כדי לרכוש, ועל שדה הראייה של 60 מיקרון זה היה רק לתת גודל פיקסל של 15 ננומטר. עבור הדמיה ultrastructure של תאים ורקמות, גודל פיקסל קטן יותר הוא מתאים יותר, בדרך כלל בין 4 ל 10 ננומטר / פיקסל. עבור שטח של 60 x 60 מיקרון התמונה תהיה רכשה 10 שעות, גם אם המיקרוסקופ היה ביכולת זו. מסיבות אלה, המיקרוסקופ הוא כלי אידיאלי עבור כרכים התמונה בסדר גודל של 10 x 10 x 10 מיקרון, או אזורים משמעותי של תאים שלמים. זה יכול להיעשות בקלות בתוך פרק זמן 48 שעות ביממה על דגימות היטב בניגוד הליך זה.
עד כה בפרוטוקול שימש בעיקר ברקמת המוח, כמו גם סוגים שונים של בתאי יונקים בתרבית דבקות coverslips. עם זאת, ההליך קיבעון והכתים ניתן להשתמש עם סוגים רבים אחרים של חומר ביולוגי, כולל חומר צמחי לייצר תמונה שווה ערימות היטב בניגוד.
לכן היתרון העיקרי של טכניקה זו היא יכולתה כרכים תמונה עם voxels איזוטרופיים. ערימות תמונה מסוג זה לאפשר ניתוחים נפח 3D באמצעות תמונות שצולמו על כל מטוס בערימה. היתרון של זה היא לאפשר את הצופה תכונות תמונה בסדרה את התמונה מכל כיוון ומתן בפירוט תמונה גדולה יותר (איור 3).
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
