Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

بروتوكول السريع لتحديد المباشرة للالمعوية البرازية والأنواع الأخرى من معوي ثقافة الدم إيجابية باستخدام حمض الببتيد الأحماض النووية في مقايسة فلوري التهجين الموضع (FISH السلطة الوطنية الفلسطينية).

Abstract

المعوية هي سبب شائع للتجرثم مع هاء البرازية هي الأنواع السائدة تليها faecium هاء. لأن المقاومة للأمبيسلين وفانكومايسين في E. لا يزال من غير المألوف مقارنة البرازية المقاومة في faecium هاء ، وتطوير الاختبارات السريعة السماح التفريق بين الأنواع enterococcal المهم للعلاج المناسب والمراقبة المقاومة. وهاء البرازية FISH السلطة الوطنية الفلسطينية OE مقايسة (AdvanDx ، وبرن ، MA) يستخدم أنواعا معينة من الحيوانات الببتيد حمض النووي (السلطة الفلسطينية) تحقيقات في مضان التهجين في تنسيق الموقع ويوفر الوقت لنتائج 1.5 ساعة وإمكانية توفير معلومات مهمة عن أنواع محددة العلاج. وقد أجريت دراسات متعددة المراكز لتقييم أداء E. 1.5 ساعة البرازية / عمر الفاروق الداخلي FISH السلطة الوطنية الفلسطينية إلى إجراء مقارنة الأصلي مقايسة 2.5 ساعة وأساليب البكتريولوجيا معيار لتحديد المعوية مباشرة من زجاجة الدم ثقافة إيجابية.

Protocol

1. جمع العينات وإعداد

  1. جمع الدم الوريدي من المرضى الذين يشتبه في الإنتان ووضعها موضع اثنين (سباركس دينار بحريني ، MD) BACTEC زجاجات ثقافة الدم واحد واحد الهوائية اللاهوائية ، التي تشكل معا مجموعة واحدة ثقافة الدم.
  2. المكان زجاجات من صك BACTEC 9240 بنحو 35 درجة مئوية.
  3. احتضان حتى يتم تشغيل أداة التنبيه الى نتيجة لنمو الكائنات الحية في الدم زجاجة الثقافة.
  4. إزالة زجاجة من الدم صك الثقافة.

2. إعداد الكواشف قبل يلطخ

  1. إعداد الحل غسل بإضافة 4 مل من محلول الغسيل 60x تليها 240 مل من المياه العذبة أو منزوع الأيونات المقطر مباشرة إلى الصحن تلطيخ.
  2. وضع الطبق في تلطيخ 55 درجة مئوية إلى حمام ماء دافئ.
  3. تخزين التركيز على ما تبقى 2-8 درجة مئوية.
  4. إزالة متوسطة متزايدة من الثلاجة والحارة إلى درجة حرارة الغرفة.

3. تلطيخ غرام

  1. دوامة بلطف زجاجة ثقافة الدم.
  2. استخدام الإبر والمحاقن أو جهاز subculturing ، إزالة الدم (حوالي 5 مل) من الزجاجة وضعها في أنبوب توج برغي معقمة.
  3. باستخدام ماصة معقمة ، ضع نقطة واحدة كبيرة من الدم على شريحة ميكروسكوب زجاجية.
  4. الهواء الجاف الشريحة والإصلاح في الميثانول لمدة 10 ثانية.
  5. تتيح الشريحة في الهواء الجاف.
  6. تنفيذ غرام وصمة عار على الفيلم الدم لتحديد مورفولوجية الكائن نموا في الدم زجاجة الثقافة.
  7. باستخدام عدسة الغمر النفط ، عرض الشرائح. مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل قصيرة لوحظ على وصمة عار الغرام هو الأكثر اتساقا مع الأنواع معوي.
  8. هذه النتيجة محركات غرام وصمة عار ثم اختيار المجموعة المناسبة التحقيق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية لاستخدامها لتحديد البكتيريا. وسوف يلطخ هذه الثقافة الدم باستخدام E. البرازية / عمر الفاروق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية وصمة عار.

4. السلطة الوطنية الفلسطينية FISH اللطخة

  1. مزيج الأنبوب الذي يحتوي على الدم بلطف يحوم قبل إعداد تشهير.
  2. مكان واحد قطرة من محلول التثبيت على البئر لمجهر السلطة الوطنية الفلسطينية الشرائح السمكية.
  3. نقل 10 ميكرولتر أو قطرة واحدة صغيرة من الأنبوب مع ثقافة الدم إيجابية في الحل التثبيت وتخلط برفق لاستحلب.
  4. إصلاح مسحات منهم عن طريق التسخين لمدة 20 دقيقة. عند درجة حرارة 55 مئوية على صفيحة التسخين.

5. مراقبة جودة المواد

يجب أن يتم اختبار أحدهما إيجابي والآخر سلبي الشريحة مراقبة الجودة مع كل دفعة من الشرائح لتلطيخ.

  1. استخدام E. البرازية / عمر الفاروق التحكم الشرائح التي تم شراؤها من AdvanDx لهذا الغرض أو تحضير مسحات من ثقافات السائل من سلالات مرجعية E. البرازية وهاء faecium والتحكم إما ايجابي على شرائح منفصلة أو مختلطة على شريحة واحدة ، والمكورات العقدية SPP SPP أو كمادة للمراقبة السلبية.

وينبغي أن نتائج مراقبة الجودة تكون قادرة على رصد لظروف الاختبارات المناسبة ، وخصوصا تلك التي تؤثر على التقشف وتهجين الخلية اختراق الجدار ، حيث تم تصميم منهجية السلطة الوطنية الفلسطينية لتحسين اختراق جدار الخلية

6. تهجين

  1. إضافة قطرة واحدة من E. البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية إلى البئر على الشريحة المجهر مع مسحة.
  2. إضافة ساترة. تجنب فقاعات الهواء.
  3. احتضان لمدة 30 ± 5 دقائق. في 55 ± 1 درجة مئوية على لوحة التدفئة
  4. التالية مكان الحضانة الشرائح في شريحة الناقل

7. اغسل صرامة

  1. تزج الناقل شريحة في محلول غسل محمى على حرارة 55 درجة مئوية وإزالة بعناية ساترة. في كثير من الأحيان ، وساترة الشرائح قبالة عن طريق اثارة بلطف الشريحة في محلول الغسيل. أحيانا ، يجب أن تكون ساترة دفعت بلطف مع ملقط.
  2. احتضان في حل يغسل لمدة 30 ± 5 دقائق. في 55 ± 1 درجة مئوية.
  3. إزالة الشرائح من الحل غسل
  4. تتيح الشريحة الهواء الجاف

8. متزايد

  1. إضافة قطرة واحدة من متوسطة إلى تركيب كل شريحة
  2. إضافة ساترة. تجنب فقاعات الهواء.
  3. دراسة الشريحة على المجهر مضان في حدود 2 ساعة.
  4. لا تعرض الشرائح لضوء الشمس المباشر أو غيرها من مصادر الضوء القوي لأن هذا قد يؤدي إلى تبريد مضان.

9. تفسير النتائج

يجب أن تكون مجهزة المجهر مضان يستخدم لفحص الشريحة مع تصفية النطاق المزدوج AdvanDx وهدف النفط 60x أو 100X. وينبغي دراسة الشرائح QC أول تأكيد أن التهجين لم يحدث. E. وينبغي أن تبدو وكأنها البرازية مكورات مشرق الفلورية الخضراء في حقول متعددة من عرض وfaecium E. سوف تظهر مكورات أحمر مشرق. وينبغي عدم الانزلاق السيطرة المعوية تظهر nonfluorescent. بعد التأكد من نظام الضوابط ، يمكن فحص الشرائح المريض. في البداية فيل الدمسوف تظهر م المحمر ولكن حمراء زاهية ومكورات الخضراء سوف يكون واضحا تماما.

الشكل 1
أمثلة الممثل الشكل 1. الخضراء إيجابية E. البرازية (يسار) ، والأحمر إيجابية E. faecium (وسط) ، ونتائج الاختبار سلبية (يمين).

10. ممثل النتائج

شملت ثلاث مؤسسات في محاكمة متعددة المراكز السريرية تقييم هذا السمك السلطة الوطنية الفلسطينية وصمة عار ومقارنة بروتوكول 2.5 ساعة إلى 1.5 ساعة تقصير بروتوكول للتو تم استعراضها. ما مجموعه 152 الروتينية مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل (GPC) أدرجت ثقافة إيجابية زجاجات الدم في هذه الدراسات. كان هناك 100 ٪ (152/152) اتفاق بين نتائج معدلة وإجراءات الفحص الأصلي للE. البرازية / عمر الفاروق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية : 41/41 هاء البرازية ؛ المعوية الأخرى 33/33 و 78/78 GPC أخرى (الجدول 1). وكان هذا الأسلوب تلطيخ حساسية وخصوصية رائعة خلال هذه التجارب السريرية (الجدول 2).

أساليب روتينية هاء البرازية / عمر الفاروق قياسي FISH السلطة الإجرائية هاء البرازية / عمر الفاروق الداخلي FISH السلطة الوطنية الفلسطينية القصيرة
البرازية E. 41 41 (الأخضر ايجابي) 41 (الأخضر ايجابي)
هاء faecium 27 27 (الأحمر ايجابي) 27 (الأحمر ايجابي)
هاء casseliflavus 2 2 (الأحمر ايجابي) 2 (الأحمر ايجابي)
هاء الدجاجي 2 2 (الأحمر ايجابي) 2 (الأحمر ايجابي)
المعوية الأخرى النيابة. 2 2 (الأحمر ايجابي) 2 (الأحمر ايجابي)
س. الرئوية 17 17 (السلبية) 17 (السلبية)
S. المخضرة 33 33 (السلبية) 33 (السلبية)
S. هين 1 1 (السلبية) 1 (السلبية)
س. المقيحة 3 3 (السلبية) 3 (السلبية)
S. البقرية 2 2 (السلبية) 2 (السلبية)
S. اللعابية 1 1 (السلبية) 1 (السلبية)
S. الدم 2 2 (السلبية) 2 (السلبية)
S. agalagtae 7 7 (السلبية) 7 (السلبية)
العقدية الأخرى النيابة. 7 7 (السلبية) 7 (السلبية)
تضاؤل ​​الحيوية النيابة. 3 3 (السلبية) 3 (السلبية)
Peptostrepococcus النيابة. 2 2 (السلبية) 2 (السلبية)
مجموع 152 152/152
اتفاق 100 ٪
152/152
اتفاق 100 ٪

اختبار الجدول 1. اظهر من البكتيريا باستخدام كل معيار (2.5hr) وبروتوكول السريع (1.5 ساعة).

حساسية E.faecalis حساسية أخرى معوي النيابة. خصوصية
100 ٪ (41/41)
CI 95 ٪ (93،0 حتي 100)
100 ٪ (33/33) 33/33
CI 95 ٪ (91،3 حتي 100)
100 ٪ (78/78)
CI 95 ٪ (96،2 حتي 100)

الجدول 2. الحساسية والنوعية للبروتوكول 1.5 ساعة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية.

Discussion

وهاء يمكن البرازية / عمر الفاروق مقايسة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية لتوفير تحديد معوي 2-3 أيام في وقت سابق من طرق الثقافة القياسية. إجراء تقصير للمقايسة (1.5 hourr) على التعرف السريع والتي يمكن استخدامها لتحسين النهج المتبع في العلاج المضادة للميكروبات ونتائج المرضى. وقد أجريت دراسة واحدة لدعم هذا عن طريق فورست ، وآخرون (6). على مدى سنتين متتاليتين ابتداء من عام 2005 حددت مختبر الميكروبيولوجيا مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل المتزايد في زجاجات ثقافة الدم عن طريق الأساليب التقليدية والميكروبيولوجية في عام 2006 مضيفا ان E. البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية الأسماك. بالإضافة خوارزمية العلاج التي وضعها فريق المؤسسات مضادات الميكروبات (AMT) على الاستخدام الفعال للبيانات السمكية السلطة الوطنية الفلسطينية التي تم إنشاؤها بواسطة المختبر في الوقت المناسب. والنتيجة الأولية المقررة الوقت من ثقافة الدم التعادل لتنفيذ المعالجة الفعالة المضادة للجراثيم قبل وبعد وضعت السلطة الوطنية الفلسطينية السمكية في سير عمل المختبرات. تم قياس شدة الموقع ، ومرض المريض والعلاج تجريبية مضادة للميكروبات. وجرى تقييم ما مجموعه 224 مريضا في المستشفى حصلت مع enterococcal تجرثم مع 129 في الفترة التي سبقت التدخل و 95 في الفترة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية. حددت السلطة الوطنية الفلسطينية FISH E. البرازية 3 أيام في وقت سابق من الثقافات التقليدية (1.1 مقابل 4.1 يوم ، ف <0.001). حددت السلطة الوطنية الفلسطينية FISH E. faecium الوسيط 2.3 يوم في وقت سابق (1.1 مقابل 3.4 يوم ، ف <0.001) وكان مرتبطا مع تخفيضات كبيرة إحصائيا في الوقت المناسب لبدء العلاج الفعال (1.3 مقابل 3.1 يوم ، ف <0.001) ، وانخفض لمدة 30 يوما وفيات (26 ٪ مقابل 45 ٪ ، ع = 0.04). وخلص إلى أن هذه المجموعة E. أسفرت البرازية / عمر الفاروق مقايسة السمكية بالتعاون مع السلطة الوطنية الفلسطينية خوارزمية AMT العلاج في وقت سابق من بدء العلاج المناسب التجريبية المضادة للميكروبات للمرضى المصابين بعدوى المستشفيات E. faecium تجرثم الدم.

  1. يجب أن لا تستعمل الكواشف بعد لا ينبغي تواريخ انتهاء الصلاحية المطبوع على التسميات والكواشف يمكن تعديلها في أي شكل من الأشكال. ينبغي أن تبقى في الثلاجة عندما لا تكون قيد الاستعمال أو أنها يمكن أن تفقد قوتها.
  2. ثقافة زجاجات الدم تحتاج إلى أن تكون مختلطة قبل أخذ العينات.
  3. من المهم عدم السماح للطرف زجاجة بالقطارة للمس مسحة الدم لأن هذا قد يسبب تلوث المواد عبر بين الشرائح ، أو التسبب في تلوث الكاشف.
  4. تأكد من المحافظة على المياه والاستحمام كتلة التدفئة في 55 درجة مئوية ثابتة
  5. لا تستخدم سوى مرشحات تصفية النطاق المزدوج أو الألوان لن يتم تمييزها بوضوح.
  6. لا تستخدم شرائح مجهرية أخرى من شرائح ميكروسكوب أو التهجين لن يحدث.
  7. من المهم أن مجهر يعمل بشكل صحيح. تأكد من لمبة المجهر هو ضمن عدد من الساعات المعتمدة للاستخدام.
  • لم يتم الكشف عن بعض الأنواع النادرة التي تحدث المعوية عن طريق المسبار السلطة الوطنية الفلسطينية لأنواع التهجين المعوية الأخرى ، مثل asinii E. ، E.dispar ، haemoperoxidus E. ، cecorum E. ، columbae E. ، saccharolyticus E. ، المفرد هاء وهاء . كبريتية.
  • يتم تعريف هاء هاء كما moraviensis بسبب التشابه تسلسل البرازية.
  • بعض سلالات بكتيريا تنتج ذبحية مضان إيجابية كاذبة الأخضر بسبب التشابه تسلسل.
  • لم يتم تقييمها زجاجات VersaTREK ثقافة الدم خلال الدراسات السريرية. أداء للكشف عن E. والمعوية البرازية غيرها من النيابة. مع زجاجات VersaTREK ثقافة الدم غير معروف.
  • وقد تألق ذاتي الخضراء إيجابية كاذبة تحدث إذا تم استخدام معيار FITC مرشح بدلا من تصفية النطاق المزدوج.
  • قد تحدث نتائج سلبية كاذبة نادرا بسبب النمو مختلطة أو بسبب خطأ في تقنية الفحص.
  • ونوع وحالة الأجهزة المستخدمة تؤثر على المظهر المرئي للصورة التي تم الحصول عليها. قد مضان varydue لنوع المجهر العاملين ، ومصدر الضوء ومستوى الرنا الريباسي في الخلايا
  • هناك حاجة إلى عزلة على وسائل الاعلام الصلبة للتمييز نمو مختلطة مع غيرها من الكائنات وتحديد مزارع الدم ايجابية مما أسفر عن النتيجة السلبية.
  • لم يتم التحقق من صحة المنتج مع عينات أخرى من الثقافات الدم.

Disclosures

وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو AdvanDx. بنيامين كريستال هو موظف من AdvanDx ، الذي يجعل من الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgments

وكانت الدراسات التي ترعاها AdvanDx.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
إجراء 1.5 ساعة لتحديد<em> معوي</em> أنواع الثقافات مباشرة من الدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter