Det tillhörande kromosom fällan (ACT)-analysen är en roman objektiva metod för att identifiera långsiktiga DNA-interaktioner. Karakterisering av långa interaktioner räckvidd DNA ger oss möjlighet att fastställa förhållandet av kärntekniska arkitektur genuttryck i både normal fysiologi och olika sjukdomar.
Genetisk information kodas av DNA är organiserat i en komplex och starkt reglerad kromatinstrukturen. Varje kromosom upptar ett visst territorium, som kan ändras beroende på stadium av utveckling eller cellcykeln. Genuttryck kan uppstå i specialiserade transkriptionell fabriker där kromatin segment kan slinga ut från olika kromosom territorier, vilket leder till co-lokalisering av DNA-segment som kan finnas på olika kromosomer eller långt ifrån varandra på samma kromosom. Associated Kromosom Trap (ACT)-analysen ger en effektiv metod för att identifiera dessa långsiktiga DNA-föreningar på ett opartiskt sätt genom att utvidga och modifiera kromosom tekniken konformation fånga. ACT-analysen gör det möjligt för oss att undersöka mekanismerna för transkriptionell reglering i trans, och kan förklara sambandet mellan kärnkraft arkitektur genuttryck i normal fysiologi och vid sjukdomstillstånd.
Dekker et al. Utvecklat kromosomen konformation capture (3C) metod för att upptäcka förekomsten av interaktion mellan två genomiska lokus 1 och 3C har använts i stor omfattning för att undersöka intra-kromosom-och inter-kromosomala associationer mellan två kända DNA-regioner i däggdjursceller 2 -9. Även nyutvecklade Hi-C metoden kan användas för studier av arvsmassan hela DNA-förening, är ACT-analysen fortfarande en effektiv teknik för studier av locus-specifika DNA-interaktion 10-11. Vi har modifierat denna metod för att identifiera okända DNA-regioner som är förknippade med en känd DNA-region i odlade mus och humana celler (Figur 1). Vi döpte denna metod tillhörande kromosomen fällan (ACT)-analysen, eftersom det gett oss en pålitlig och reproducerbar metod för att identifiera nya okända DNA-partners som förknippar med en känd mål-DNA regionen 12. En framgångsrik 3C-analysen med lämpliga kontroller görs innan den nya aspekter av ACT-analysen 13. För tofind så många associerade DNA-regioner som möjligt är det nödvändigt att använda olika kombinationer av första och andra begränsning enzymer. Det är särskilt viktigt att använda restriktionsenzymer som är okänsliga för CpG metylering genomföra de första 3C ligering steg. Proteinbindning och DNA-metylering kan också påverka begränsning effektivitet enzym matsmältningen och kan leda till fel i ligation de associerade DNA-regioner för vissa digestions restriktionsenzym. Förekomsten av intra-och inter-kromosomal ligation beror på protein-DNA tvärbindning och lämpliga fysiska kartor över både de associerade DNA-regioner. Således några preliminära experiment nödvändigt att skapa en praktiskt effektiv formaldehyd koncentration och behandlingstiden i ACT-analysen. En rad slutliga koncentrationer formaldehyd (from1.5% till 2%) har använts i flera laboratorier under 3C delen av analysen 7,9. Alternativt kan oligonukleotider används som linkers vara utformade för att matcha sammanhållande ändskär av den andra begränsningen enzymet. Även om vi funnit att 18-20 cykler i den första omgången av PCR och 20-25 cykler i den andra omgången av PCR kan ge tydliga band, är det nödvändigt att fastställa de bästa PCR-förhållanden för varje experiment (figur 2). Intra-molekyl glödgning mellan 5'-änden och 3'-änden kompletterande adaptern sekvens av en DNA-sträng kan uppstå i PCR, hämmar det adapter-specifik primer glödgning med DNA-molekylen, och resulterade i mycket lägre förstärkning effektivitet i de första omgångarna. Efter mål-DNA förstärktes för cyklar, kan dess belopp vara mycket större än dessa ospecifika reaktioner, och kan underlätta konkurrens primer glödgning till molekyler mål-DNA. Det är också därför vi kan se bakgrunden förstärkning, och varför den första omgången PCR-produkten måste spädas för att minska bakgrunden amplification.It är viktigt att avlägsna överskott av primers från PCR-reaktionen för att minska bakgrunden i den andra omgången av PCR. Som i alla PCR-experiment är det viktigt att designa primers som inte är belägna i områden repetera sekvens, som utgör majoriteten av mänskliga och mus DNA. Även nyutvecklade Hi-C metoden kan användas för studier av arvsmassan hela DNA-förening, är ACT-analysen fortfarande en effektiv teknik för studier av locus-specifika DNA-interaktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Adelle Murell och Wolf Reik mycket för att dela sina 3C protokollet. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet och Research Service av Department of Veterans Affairs.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |