O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.
Informação genética codificada pelo DNA é organizado em uma estrutura complexa e altamente regulamentado cromatina. Cada cromossomo ocupa um território específico, que pode mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento ou do ciclo celular. Expressão gênica pode ocorrer em fábricas especializadas em segmentos transcricional da cromatina podem loop out cromossomo a partir de territórios diversos, levando a co-localização de segmentos de DNA que podem existir em cromossomos diferentes ou distantes no mesmo cromossomo. A Associated cromossomo Armadilha ensaio (ACT) fornece uma metodologia eficaz para identificar essas associações de longo alcance DNA de uma maneira imparcial, estendendo e modificando o cromossomo técnica de captura de conformação. O ensaio ACT torna possível para nós para investigar os mecanismos de regulação da transcrição em trans, e podem ajudar a explicar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene na fisiologia normal e durante estados de doença.
Dekker et al. Desenvolveu o cromossomo conformação capturar abordagem (3C) para detectar a freqüência de interação entre dois loci genômicos 1 e 3C tem sido amplamente utilizado para investigar associações cromossômicas intra-e inter-cromossômicas entre duas regiões do DNA em células de mamíferos conhecidos dois -9. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA 10-11. Nós modificamos essa abordagem para identificar regiões do DNA desconhecidos que estão associados a uma região do DNA conhecido no rato cultivadas e células humanas (Figura 1). Chamamos este método na armadilha cromossomo associado ensaio (ACT), uma vez que nos forneceu um método confiável e reprodutível para identificar novos parceiros DNA desconhecidos que se associam a uma região conhecida de DNA alvo 12. Um ensaio bem sucedido 3C com controles adequados é feita antes de executar os aspectos novos do ensaio ACT 13. A fim tofind tantas regiões do DNA associado quanto possível, é necessário o uso de várias combinações de enzimas de restrição primeiro e segundo. É especialmente importante o uso de enzimas de restrição que são insensíveis a metilação CpG para realizar a etapa ligadura primeiro 3C. A ligação às proteínas e metilação do DNA também podem influenciar a eficiência restrição de digestão enzimática e pode levar à insuficiência de ligadura das regiões DNA associado para digestões certas enzimas de restrição. A ocorrência de ligadura intra ou inter-cromossômicas depende de proteínas DNA-cross-linking e apropriado mapas físicos de ambos das regiões DNA associado. Assim, alguns experimentos preliminares são essenciais para estabelecer uma possível concentração de formaldeído eficaz e tempo de tratamento no ensaio ACT. A gama de concentrações finais de formaldeído (from1.5% para 2%) têm sido utilizados em diversos laboratórios durante a parte 3C do ensaio 7,9. Alternativamente, os oligonucleotídeos utilizados como linkers pode ser projetado para combinar com o final coesa cortado pela enzima de restrição segundo. Embora descobrimos que 18-20 ciclos na primeira rodada de PCR e 20-25 ciclos no segundo turno da PCR poderia fornecer bandas claras, é necessário estabelecer as melhores condições de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula annealing entre seqüência adaptador 5'-end e 3'-end complementares de uma cadeia de DNA pode ocorrer em PCR, inibe específicas do adaptador primário de recozimento com a molécula de DNA, e resultou em eficiência de amplificação muito mais baixo nos primeiros ciclos diversos. Após o DNA alvo foi ampliado para os ciclos, o montante pode ser muito maior do que estas reações inespecíficas, e pode facilitar a competição de primer annealing para as moléculas de DNA alvo. É também por isso nós podemos ver a amplificação de fundo, e porque o primeiro produto da PCR rodada tem que ser diluído para diminuir amplification.It fundo é importante para remover excesso de primers a partir da reação de PCR, a fim de diminuir a fundo na segunda rodada de PCR. Como em todos os experimentos baseados em PCR, é essencial para projetar primers que não estão localizados em regiões de repetição de seqüência, que constituem a maioria do DNA humano e do rato. Embora recém-desenvolvida metodologia de Hi-C pode ser aplicado para o estudo do genoma de DNA associação, ensaio ACT ainda é uma técnica eficaz para o estudo do locus específico de interação DNA.
The authors have nothing to disclose.
Nós graças Adelle Murell e Wolf Reik muito para compartilhar seu protocolo 3C. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa eo Serviço de Pesquisa do Departamento de Assuntos de Veteranos.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |