昆虫に適応運動行動の神経基盤を研究し

Summary

我々は、滑りやすい路面上を歩いて、テザー昆虫で電気的に記録された足根接点信号にタイミング、運動活動を記録する方法を説明します。これは、基板を介して足の間の機械的相互作用の低下の影響下で適応行動の神経基盤を研究するために使用されます。

Abstract

動作を歩行の神経基盤を研究し、人はしばしば、それが基材と一般的な接触を介して他の足を搭載するパッシブ力との相互作用から生じるもの足の動きからneuronally生成されたステップの出力を分離することが困難であるという問題に直面している。我々は神経系のモーターの出力によって生成される特定の動きの一部、理解したい場合は、動きをステップの運動学的分析は、したがって、運動活動の電気生理学的記録を補完する必要があります。行動を、動物の神経や筋肉の活動の記録は、できるだけ頻繁に自由のように何度と移動する能力に動物を拘束することができる電気機器によって制限されます。このどちらかの植込み型電極を使用して、長いテザーでの動物の動きを持つことで回避できる（すなわちClarac ら、1987;。Duch＆プフリューガー、1995;ベームら、1997;。グルーン＆Rathmayer、2002）または送信することにより遠隔測定装置を使用してデータ（Kutschら、1993;フィッシャーら、1996;。土田ら2004;。ハマら、2007;。Wangら、2008。）。成功した大規模な節足動物で使用されているこれらのエレガントな方法で、、の両方は、しばしばどちらか簡単に長い​​テザーに巻き込ま取得が小さい歩行の昆虫に適用することが困難証明したり、遠隔計測装置の重量とその電池によって妨げています。さらに、これらすべてのケースで、それは運動の純粋な神経基盤と基板を介して歩いて足の間に機械的結合により発揮される効果とを区別することは不可能です。この問題に対する一つの解決策は、場所に歩いて自由であり、局所的に効果的にほとんどの接地接触機構を削除滑りやすい表面、上の例のために、中断されている係留動物で実験を行うことです。 、後方歩行（グラハムとEpstein、1985）または、（グルーンら、2009A。Trybaとリツマン、2000A、B）を回す、、これはエスケープ応答を（カムハイとLevy、1988カムハイとノレン、1981）の研究に使用されています速度の変化（グルーンら 、2009B）、それは実験者が容易に運動学的分析（グルーンら 、2006）と細胞内および細胞外生理機能を組み合わせることができます。

我々は、タッチダウンなど無傷の減少の準備にまっすぐ進むと曲線歩行のような異なる行動パラダイムの下にリフトオフに関連して動作してナナフシで脚の筋肉のタイミングを調査するために滑りやすい路面のセットアップを使用してください。

Protocol

1。ウォーキング表面

黒の歩行面は2つのニッケルで構成されているコーティング真鍮プレートは永久に並んで参加し、電気的に直接の縦軸の下に2液硬化型エポキシ系接着剤（UHUプラス、UHU GmbH、ドイツ）の2mm幅のストリップによって互いに絶縁さ動物。彼らは、13.5x15.5cmの総表面積（図1）を生成する。左右の脚のための半面の分離は、各側の片脚ごとに独立した足根の接触を監視することができます。

1. プレートは、滑りや電気伝導度を伝えるためにNaCl型ソリューションを飽和5部〜95部のグリセリンの割合でグリセリン/水混合で潤滑され、粘度は、（Shankarとクマール、1994）約430cStokesです。
2. 混合物を表面に直接適用され、0.1〜0.2ミリメートルの全体の厚さを確保するための軟組織の一部を分散している。

2。光刺激のセットアップ

1. ウォーキングのエピソードは、およその距離に位置されている2つのラウンド、すりガラスのスクリーン（直径130ミリメートル、Marata画面、リノスフォトニクス、ゲッティンゲン、ドイツ）の上に縞模様を投影するScharstein（1989）によって記述された2台のプロジェクタを使用して惹起されています。目から、そしてプレートの左右のフロントエンド（図1）45 °の角度で70ミリメートル。縞模様の波長はλ= 21 °で一定に保たれる。移動刺激のコントラストの周波数を0.35、0.72、1.07と1.49Hzの間で変化することができます。動物の反応が唯一のコントラストの周波数ω/λ（ω=角速度、λ=パターンの波の長さ）に依存するので、パターンのコントラストが（フェルミとReichhardt、1963）十分に高ければ、我々は、実験を通してλを変化しなかった。動物の側に明るい縞の輝度は約15cd/m2とコントラスト0.8です。ナナフシの複眼（カラウシウスmorosus）は24背腹軸のommatidiumの複数形（Friza、1928）とrostro -尾軸にさらにいくつかを持っています。ナナフシ目の発散角は平均6.2 °（Janderとボルク-ヘンリッツ、1970）上にあるとして、我々のパターンの波長はommatidiumの複数形の約4倍の角度だった。実験は暗いファラデーケージに設定し、20から22で暗い部屋℃で行われる
2. 前方に歩行は、各画面上に縞模様が外側へ移動する両方の画面、または画面の間に置かれた白い背景の上に1本の黒線上に進歩的なパターンによって誘導される
3. 旋回は、両方の画面で同じ方向に移動する縞によって誘導される。我々は、移動縞の速度と回転の角度との相関関係を発見していない。かつて縞模様の輝度が歩行誘導するために設定されている、それは通常以上の調整を必要としませんが、プロジェクターのハロゲンランプの電圧によって必要に応じてさまざまな動物のために調整することができます。

3。実験動物の準備

1. 女性の大人のナナフシ（カラウシウスmorosusは）複数のコネクタを持っている真鍮の管に挿入されている細いバルサ棒（3x5x100mm、WxHxL）、上（歯科用セメント、ProTempII、3M ESPE、ゼーフェルト、ドイツ）腹側を下に接着されています。接着剤は、少なくとも部分的に硬くなるまで、動物は約1分のために抑えています。
2. 頭部や脚部は、彼らの自由な動きを可能にするために釘の正面と側面から突出している。すべての脚の股関節の領域だけでなく、腹部の大部分は、接着剤の自由なままにする必要があります。
3. 昆虫頭部、胸部、そしてそれぞれの大腿骨と脛骨の遠位端は、後でビデオトラッキング用の歯科用セメントを混合した蛍光顔料（博士クレーメルFarbmühle、Aichstetten、ドイツ）が付いています。

4。 EMGの電極の配置

この例のような別の脚の筋肉の筋活動、、胸部および原因の延長（前進）と脚の引き込み（後退）に配置されて分度器とリトラクターの股関節の筋肉は、筋電図の電極によって記録されています胸部に移植。すべてEMGの記録は差動増幅されています。信号はさらに（Vers.5.05、CED、（10倍）増幅、およびspike2にADコンバータを使用してインポート、プリアンプ（エレクトロニクスワークショップ、動物学研究所、ケルン）、バンドパスフィルタ処理、（100Hzから2000Hz）で100倍増幅したケンブリッジ、英国）。

1. 電極は、被覆銅線（;47μm、外径Elektrisola、Eckernhagen、ドイツ）から作られています。一方の電極の場合は、2本のワイヤは、最初の2つの粘着性のワイヤがお互いの周りをツイストされ、その後、接着剤にまみれている
2. 一方の端には撚り線の両端がミニプラグに半田付けされています。もう一方の端にワイヤが動物への挿入のための断熱材なしできれいな端を提供するためにカットされています。
3. EMG電極はpluggeですD真鍮の管の端の小さなコネクタに接続します。
4. minutenピンは表皮に小さな穴を開けるために使用されます
5. 電極の切断端部はその後、私たちの経験では、雑音比に良好な信号を与える、お互いから約1mmの距離、で区切られ、筋肉に挿入されます。ケアは、その損傷を避けるためには筋肉内への深すぎるの電極を挿入しないように注意してください。図2は、動物の胸部に電極の位置を示します。図3は、代わりに電極ワイヤを持つ動物を示しています。
6. 我々は場所にワイヤーを保持するためにhistoacrylic接着剤（3M Vetbond、セントポール、ミネソタ州、米国）の小さなドロップを使用してください。
7. アース線は、腹部に挿入されます。

5。足根連絡先の記録

瞼の接触は、常にEMGトレースとともに記録されます。滑りやすい表面を二つに分割されているので、二つの対側足根接点の最大を同時に登録することができます。この目的のために、足はプレートとアンプ間の回路を閉じて"スイッチ"として使用されます。現在は、各プレートの底にある2つのソケットを介して別々にプレートに適用することができます。我々は、90 °位相遅延されているパルス発生器（モデルMS501、エレクトロニクスワークショップ、動物学研究所、ケルン）2 - 4mVの振幅二つの方形波信号を生成することができます。信号は60dB（/ 1000）と滑り面の二つの部分に適用することによって減衰されます。この実験では2つだけの信号のいずれかを使用してください。それは同時に参照信号としてロックインアンプに供給されます。 2相ロックインアンプ（電子工学ワークショップ、動物学研究所、ケルン）は選択的に提供されるリファレンス信号と同じ周波数と位相の信号のみを増幅する。番目のチャネルは90 °の位相遅延信号を検出する。基準周波数以外の周波数でのノイズ信号が拒否され、測定には影響しません。アンプの出力信号はAD変換器（マイクロ1401k II、CED、ケンブリッジ、英国）とデジタル化を使用してSpike2に供給されます。タッチダウンおよびリフトオフ足根の上や滑りやすい路面からの間に、銅線に足根と脛骨を介してプレート（下記参照：5.3から5.8に）から電流が流れる。選択されたアンプは高入力抵抗（1MΩ）を持ち、信号電圧は、動物の歩行動作に影響を避けるために非常に小さいです。足根と脛骨を流れる電流は、2と4NAの間です。潤滑剤への参入と面接触との間のタッチダウン時の信号のリードタイムは、1ms以下です。リフトオフ時に接点信号の遷移が緩やかとより多くの遅延です。これは、遅れることなく、毛管上昇の効果で足根から潤滑剤の引き裂きや足の動きに起因するためである完全な遊脚相でのリフトオフ。

1. 動物が接着されているバルサの棒と真鍮の管は、7〜自由歩行時の高さに対応する滑りやすい表面、上記の12ミリメートルで、動物の高さ調整を可能にするためにマニピュレータに挿入されます。
2. 監視対象の足の虫足根が地上にあるたびに、電流の流れを測定するために、ワイヤ（47μm径）約15センチメートル長いずつに分けられます。
3. 銅の絶縁体は、アルコールとのそれを離れて燃焼によって除去される。
4. ループは、ワイヤの一端に形成され、動物の足根を上にスライドさせる
5. ループは、動物とワイヤ間の良好な接触を提供するために、脛骨の遠位端に接続されています。
6. ワイヤーは、2つの成分​​の接着剤（ProTempII、上記参照）のドロップと動物の胸部に固定し、ワニクランプを介して差動アンプに接続されています。
7. その両端のワイヤの導電性を向上させるために、電極のクリームの滴は接触の領域に（マルケットHellige、フライブルク、ドイツ）が適用されます。
8. 信号強度は、モニター上でテストされています。ロックインアンプのローパスフィルタ特性（定数10msの時間）と足根が徐々にlift-off/touch-downに起因する、信号が正確な矩形波ではありません。一つは、したがって、眼瞼の接触の正確なタイミングを判断し、手動でデジタル化ソフトウェアによって決定された各イベントをチェックするために近い遷移点に適したしきい値を設定する必要があります。瞼の接触に基づいて、我々は与えられた足の足根はスタンス、それは遊脚期のような空気になっていた時間として地上にいた時間を定義する。
9. カメラ用のトリガー信号は、EMGのトレースおよび足根接点信号と同時に記録し、行動と記録されたトレースのフレームの相関関係によって正確なフレームを可能にしています。

6。デジタル解析のための足の動きの光学的記録

滑りやすい路面上でナナフシのステップ周波数は3 - 4Hzの（グラハムとクルーズ、1981年）に到達することができます。

1. 歩行シーケンスを記録する前に、ミラーは、タッチダウンのための追加の視覚的なモニターを持っている動物の後ろに45 °の角度で配置されます。カメラは、外部トリガされ、画像は、FireWireインターフェースを介してPCに供給されています。
2. 我々は、デジタル足の動きを分析するために100FPSでのハイスピー​​ドビデオカメラ（マーリンF - 033C、アライドビジョンテクノロジーズ、Stadtroda、ドイツ）で、上からシーケンスを歩いて記録し、筋電図活動と眼瞼の接触でそれらを相関させる。
3. 歩行シーケンスの録音中に、動物は、青色LEDアレイ（30 - 50V DC、輝度24cd、エレクトロニクスワークショップ、動物学研究所、ケルン大学）蛍光マーカーを照らすために強度が調整されている、と点灯します。文学（Schlegtendal、1934）によると、ナナフシは色覚を有していないと我々は回転応答のUV光の照射の悪影響は確認されていません。カメラレンズの前面にある黄色のフィルタは、アクティベーション光の短波長を抑制し、ビデオ録画のためのより高いコントラストを与える。
4. ビデオファイルは、モーショントラッキングソフト（WINanalyze、Vers.1.9、Mikromakサービス、ベルリン、ドイツ）を用いて解析することができます。

7。歩行シーケンスの記録

1. 対照として、無傷の動物との最初の歩行シーケンスが記録されます。
2. 縞模様の速度に設定されており、パターンおよびビデオ録画は、ほぼ同時に開始されます。
3. 動物が自発的に運動を開始しない場合は、ブラシで腹部（バスラーとヴェゲナー、1983）で、またはアンテナへの空気のパフによる刺激することができる。このケースでは、動物は腹部の左側に触れるには、左、およびその逆にする傾向がある。動物が歩いたり、連続録音の3分後まで停止するまで、縞模様が動いて保持されます。
4. 一本足の筋肉の活動が近隣の足からの感覚入力に依存してどのくらいテストするためには、動物がその足を自切するために誘導される。自切のサイトは数秒以内に自然に閉じます。 autotomized前面と後脚を持つ動物の例を図3に示されています。
5. 例えば、唯一の中間の脚を有する動物での実験のために、我々は、ピンセット（シュミットとグルント、2003）との近位大腿骨をつまんでプロと後胸の脚の自切を引き起こすか、股関節のレベルで足を切断無傷の動物から記録した後。その後、回復時間のための30の最小値は、動物に与えられます。
6. その後、我々は以前と同じように新しい歩行シーケンスを記録する。減少の準備で、私たちはしばしばペイントブラシストロークを用いた歩行誘導する必要があります。

8。代表的な結果：

図1実験装置;：。滑りやすい表面上につながナナフシの写真、足の追跡のための蛍光色素でマークとEMGの記録と足根接触測定用に配線。 B：滑り面上歩行時の二重足足根の接触記録のための配線図。

図2。ナナフシの真ん中の足の胸部に分度器とリトラクタ筋肉の筋電図の電極の配置のための位置。 ML：中央の脚部、FL：前脚

図は、3つの場所の真ん中の足のプロとリトラクターの筋肉に筋電図の線で昆虫を守っています。前面と後脚はで真ん中の脚の運動と筋活動に隣接する脚の存在の影響を研究するために削除されています縮小準備。

旋回時の内側の中央脚の足根接触の基準信号とリトラクターEMG活動の4例のトレース図 。脚が脚が前方にステップになることを示す、地面との接触を（"クローズドサーキット"）があるが、トレースの開始時に（最初の青いボックス）リトラクターは、スタンス中にアクティブである、短いスイッチ（第二青いボックス）の後、足が後方ステップ誘導の発生を示す、空気（"オープン回路"、第三青箱）にあるときにリトラクターは、スイング中にアクティブになります。

図5。分度器（上側のトレース）とリトラクター（真ん中のトレース）の筋肉と同時に記録された瞼の接触のトレース（下のトレース）から記録のスクリーンショット。ステップのサイクルで2つの筋肉の活動に対応する筋電図のトレースで交互に動作を確認してください、それだけで前と中に分度器の活動です。スイング、足がスタンスになって後、タッチダウン足根中足根接地接点の接触トレース信号の損失、およびリトラクターの活動、。インサートは、動物の動作を検証するために使用されているこの記録に対応するマッチングのビデオファイルを示しています。

Discussion

我々は、大規模な程度に地面に他の歩行手足の機械的な変位によって引き起こされる受動的な影響からneuronally生成された歩行活動の脱共役を動作し、許可を回すの光学的に誘導生成を可能にする設定を記載している。床反力や足根連絡先に関する神経系を介して足の間の潜在的な情報の流れは、一方で、まだ可能であると実験者が減少した準備でそのような情報の影響を検討することができます。滑りやすい表面のセットアップの主な利点は動物が歩くことを非常に高い傾向を示し、そして踏み車の上を歩いたり、ステップに反することが含まれ、動物は自然な歩行の全方向にスイングとスタンス位相の動きを実行することができます。さらに、すべての脚の自由度は、動物はそれが完全な状態または半無傷の準備かどうかを歩いてカーブを実行することができます。脚は受動的に動物または下に基板の運動の前進するだけで移動できないため、すべての動きはその脚のモーターの出力を（;グラハムとウェントラー、1981クルーズ、1976）反映している。一肢の運動の運動学の解析と運動の電気生理学的記録を組み合わせることができるため、セットアップは、このようにしたり、前方に対後方を歩くなどの適応行動の神経基盤を調べるために非常に適している。

我々は、歩行を引き出すためにナナフシの微細運動応答を使用する。回転するストライプパターンへの動物の反応は、滑りやすい表面上をテザーしながら歩いてカーブを実行する用意があることを示しています。最も驚くほど私たちのために、単脚製剤中の一つの脚は、質的に無傷の動物で同じ移動パターンを示す。そこで我々は、カーブの歩行の制御は、近隣の足からの感覚入力の調整をすることなく、主に機能することを信じる理由を持っている。それは、削除された脚の運動ニューロンの活動も微細運動パターンに影響されているかどうか、さらに実験でテストすることが重要になります。セットアップは簡単にそのようなまっすぐ前方と後方の歩行動物の前で、単一のストライプを配置したり、静かにアンテナを引っ張って、他のタスクの調査を許可するように変更することができます。

接地の正確な測定は、私たちは筋肉の活動と足の位置を相互に関連付けることができます。この電気接点信号の高時間分解能は1msよりはましだとスイングから立脚相への切り替えのタイミングに新しい洞察力に私たちを導く。解像度は、導電性潤滑油のせん断遅れによる移行をスイングする姿勢や滑りやすい路面上で延長時のリフトオフ完全な必要性の欠如のために悪いです。それにもかかわらず、スタンスの移行に正確なスイングに関する知識は、我々は（も参照して制御筋肉のタイミングと異なる行動文脈で脚の筋肉の協調活動というメカニズムを理解する場合に特に有用な最初のステップです： らBüschges、2008;。 Büschges＆グルーン2008）。

例として、我々は真ん中の足のリトラクタと分度器股関節の筋肉を使用し、我々は、同時に足が使用された行動の文脈を監視しながら正確にスイングから立脚相への切り替えとその活性を相関していた。この目的のために、我々は、歩行を誘導し、継続的に筋活動を記録した。与えられた脚が回転方向に応じて、内部または外部に足することができます。脚が断続的に前方にステップ誘導（図4を参照に加えて、後方のステップを生成するためのステッピング真ん中の足では、機能的な意味での内部の足として機能し、それはリトラクタと分度器筋肉が機能的なスタンスの筋肉などの作業の両方ができることを観察することができます）。

両方の筋肉から電図（筋電図）は、整流され、タッチダウンの時、最初に筋肉のスパイクの待ち時間が計算された標準化した。興味深いことに、敬意を持つ両方の筋肉のレイテンシは、オフ持ち上げて、タッチダウン、それぞれのスイングやスタンスの筋肉と筋肉の機能に依存する（図4を参照）ではなく、筋肉自体、とにわずかな変化を示す活動開始のタイミング。スタンスへのスイングから状態の変化のための最も説明が足根接触トリガースタンスの開始のその感覚信号を前提としています。ナナフシのタッチダウンと筋肉の活性化の間に短い待ち時間が約、彼らが依存して感覚情報が、変更した設定で対処できるかに持って来られるかの興味深い問題。

要約すると、我々は、私たちは確実に固定ナナフシのストレートとカーブの歩行を誘発することができます滑りやすい表面のセットアップを示します。運動学、筋活動と瞼タッチダウンのタイミングとリフトオフを監視し、二つの異なる行動Cに相関させることができる同時にontexts。これは私たちに無傷の動物と根本的なメカニズムのほか、単脚のための筋活動と行動の文脈との間の詳細な接続を研究するための優れたツールを提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-component epoxy glue	UHU plus, UHU GmbH, Germany
glass screens (diameter 130mm)	Linos Photonics
dental cement	ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Germany	3M Id : 70-2011-0358-0 Catalog Number : 46430	Available through 3M (http://www.3m.com/)or dental suppliers
fluorescent pigments	Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Germany	Cat.#s: i.e 56200 Fluorescent Pigment Golden Yellow 56350 Fluorescent Pigment Flame Red	http://kremer-pigmente.de/en or http://www.kremerpigments.com/
histoacrylic glue	3M		supplier: WPI
coated copper wire	Elektrisola Eckernhagen		http://www.elektrisola.com/
electrode cream	Marquette Hellige, Freiburg, Germany		Product is now discontinued, we suggest for example: www.grasstechnologies.com
pulse generator	Model MS501, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany
lock-in-amplifier	Zoological Institute
AD converter	Cambridge Electronic Design
preamplifier	Zoological Institute
high speed video camera	Allied Vision Technologies
UV LED arrays	Zoological Institute		30-50V DC, electronics workshop λ390-395nm Luminance 24cd
Digitalizing software Spike2	Vers.5.05, CED, Cambridge, UK
motion tracking software	Mikromak service, Berlin, Germany	WINanalyze, Vers.1.9