Elastomerisk PGS ställningar med glatta muskelceller odlade på ett pulserande flöde bioreaktor kan leda till lovande liten diameter arteriell konstruktioner med infödda ECM produktion i ett relativt kort kultur period.
Hjärt-kärlsjukdom är en av de ledande dödsorsaken i USA och framför allt ökar kranskärlssjukdom med en åldrande befolkning och ökande fetma 1. För närvarande bypass-operation med autologt fartyg allogent transplantat och syntetiska transplantat är kända som ett vanligen används för arteriell substitut 2. Men dessa transplantat har begränsad program när en inre diameter av artärer är mindre än 6 mm på grund av låg tillgänglighet, trombotiska komplikationer, efterlevnad mismatch, och sen intimans hyperplasi 3,4. För att övervinna dessa begränsningar har tissue engineering med framgång använts som ett lovande alternativ för att utveckla liten diameter arteriella konstruktioner som är nonthrombogenic, robust och kompatibel. Flera tidigare studier har utvecklat liten diameter arteriell konstruktioner med Tri-lamellstruktur, utmärkta mekaniska egenskaper och sprängtryck jämförbar med infödda artärer 5,6. Medan hög draghållfasthet och brast trycket genom att öka produktionen av kollagen från ett styvt material eller cell plåt schavotten hade dessa konstruktioner fortfarande låg elastin produktion och efterlevnad, vilket är ett stort problem att orsaka transplantat misslyckande efter implantation. Med tanke på dessa frågor, hypoteser vi att en elastometric biomaterial i kombination med mekanisk konditionering skulle ge elasticitet och bedriva mekaniska signaler mer effektivt för att vaskulära celler, vilket ökar extracellulära matrix produktion och support cellulära läggning.
Syftet med denna rapport är att införa en tillverkningstekniken av porösa tubulär byggnadsställningar och en dynamisk mekanisk conditioning tillämpningsföreskrifter för arteriella vävnadsteknik. Vi använde en biologiskt nedbrytbar elastomer, poly (glycerol sebacat) (PGS) 7 för att tillverka porösa rörformiga ställningar från saltet fusion metoden. Vuxen primära babian glatta muskelceller (SMC) var seedade i lumen av byggnadsställningar, som odlas i vårt utformade pulserande flöde bioreaktor i 3 veckor. PGS ställningar hade konsekvent tjocklek och slumpmässigt fördelade makro-och mikro-porer. Mekanisk luftkonditionering från pulserande flöde bioreaktor stöds SMC orientering och ökad ECM produktion i ställningar. Dessa resultat tyder på att elastomer byggnadsställningar och mekaniska konditionering av bioreaktor kulturen kan vara en lovande metod för arteriella tissue engineering.
Tillverkning teknik med hjälp av biologiskt nedbrytbara elastomer som beskrivs här har flera funktioner. (1) Vi använde oss av hyaluronsyra (HA) som formsläppmedel. Eftersom HA är vattenlösligt, var schavotten lätt frigörs från glaset formen efter att blötlägga den i vatten. I denna rapport har vi använt 1,0 vikt / vol% av HA-lösning eftersom låga koncentrationer (<0,5 vikt / vol%) av lösningen inte är trögflytande och rinner ner så fort när vi häller den på toppen av glasrör. Att belägga HA lösning enhetligt, bläddrade vi över glasrör när lösningen flög ner botten av slangen och upprepade detta steg. Detta HA beläggning är en avgörande för vår tillverkning förfarande för att frigöra sista ställningar. (2) Vi använde värmekrympbara (HS) ärmen för att behålla salter i glasrör. Eftersom salter var tätt packade i utrymmet mellan innervägg glasrör och HS ärmen, behöll HS ärmen salter efter borttagning dorn och PTFE ring i botten av slangen. Vi skulle kunna ta bort HS ärmen enkelt genom att sätta formen i en ugn vid 120 ° C i 5 minuter och sedan få tubulär salt mallar. (3) Vi använde metoden salt fusion. Det är välkänt att salt fusion metoden kan förbättra pore samtrafikförmåga och mekaniska egenskaper genom att variera fusion tid 10. Eftersom vi använde PGS, var makro-porer som produceras av salt partiklar under lakningsprocessen, medan mikro-porer sannolikt genererats av glycerol ånga bildas vid PGS härdning som vi beskrivit tidigare 11. Därför har denna metod en potential att tillverka porösa tubulär ställningar med olika makro-och mikro-strukturer genom att variera salt partiklar samt PGS bota skick.
Den mekaniska conditioning från bioreaktor har gett pulserande flöde perfusion (maximala genomsnittliga flöde = 14 ml / min, max skjuvspänning = 15,3 Dyne / cm 2, frekvens = 0,5 till 1,7 Hz) och fysiologiskt relevanta tryck med PGS schavotten, vilket ledde till SMC tillväxt och orientering (bild 4). Dessa resultat överensstämmer med tidigare studier rapporterar att cyklisk sträcka vid denna frekvens och skjuvspänning ökar SMC spridning 12, och ECM protein produktion 13,14. Förutom SMC tillväxt och orientering, konstruera PGS stött ECM protein produktion, särskilt runt om, organiserad elastiska fibrer (bild 5) inom 3-veckors kultur i bioreaktor. Några studier med en elastomer schavotten som en liten diameter arteriell konstruera har visat mekanisk hållfasthet och sprängtryck jämförbar med infödda artärer 15, och snabb SMC integration kompatibel ställningar med spinnare kolv 16,17, medan inga elastiska fibrer hittades i dessa konstruktioner. Våra resultat tyder på att cyklisk radiella buk från bioreaktor förbättrade mekaniska signaltransduktion mer effektivt för att SMC i PGS schavotten, vilket sannolikt bidrog till att elastin syntes och organisation.
Eftersom vaskulär SMC var de enda celler som produceras ECM proteiner i vår strategi och oföretagsam endotelet och förbättra mekanisk hållfasthet är nödvändig för att utveckla ett kliniskt framgångsrika liten diameter arteriella konstruktioner. Vi har rapporterat att endotelceller co-odlade med SMC genererade en konfluenta cellslager och stöds fenotyp proteinuttryck i vår kultur villkor och mekaniska konditionering 9. Därför, baserat på vår strategi som beskrivs här, modifiering av samarbete kultur experiment förhållanden skulle vara ett nästa steg för att förbättra funktioner resulterande konstruktioner och generera nonthrombogenic, robust och kompatibel arteriell konstruera liknar infödda artärer.
The authors have nothing to disclose.
Författaren tackar Dr Jin Gao för PGS syntes, Dr Peter Crapo för insiktsfull diskussion om bioreaktor setup, Dr. Mohamed Ezzelarab och Wei Wu för explantation babian halspulsåder. Denna studie stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (R01 HL089658).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 |
Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 |
MCDB 131 | Mediatech | 15-100-CV |
Fetal bovine serum | Lonza | BW14-502F |
L-glutamine | Mediatech | 25-005-CV |
Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 |
Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech | 30-004-CI |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-031-CV |
Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |