协议描述了高通量的方法,以确定使用低温电子断层扫描和三维图像处理的膜蛋白的结构。它涵盖了样品制备的详细信息,数据采集,数据处理和解释,最后一个有代表性的目标的方法,HIV – 1包膜糖蛋白的生产。这些计算程序设计的方式,使研究人员和学生远程工作和作出贡献的数据处理和结构分析。
自从近30年前它的发现,超过60万人已经感染了人类免疫缺陷病毒(HIV) (www.usaid.gov) 。该病毒感染和破坏的CD4 + T细胞,从而削弱免疫系统,并造成获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)2。感染开始时,艾滋病病毒包膜糖蛋白“秒杀”接触的CD4 + T细胞表面的CD4受体。这种相互作用引起的构象变化,促进互动与细胞表面受体5,9在穗。在艾滋病毒感染途径的这些蛋白质相互作用的意义,使他们从根本上艾滋病毒研究的深刻重要性,并在追求一种艾滋病疫苗。
需要更好地了解艾滋病毒的细胞接触和中分子尺度的相互作用的动机技术的开发,以确定结构与细胞表面受体的蛋白质和分子,阻止感染艾滋病毒的相互作用穗。使用低温电子断层扫描和三维图像处理,我们最近表现出的能力,以确定对本土病毒的表面,在20〜Å分辨率9,14,这样的结构。这种方法不仅限于解决HIV包膜结构,并可以扩展到其他病毒的膜蛋白和脂质体重组蛋白。在这个协议中,我们描述了如何获取从纯化艾滋病毒的病毒颗粒,进而逐步通过玻璃化冷冻样品的准备,收集,低温电子显微镜数据,重组和3D数据处理量,平均和分类3D蛋白子卷的HIV包膜糖蛋白的结构,并解释结果产生一种蛋白质模型。我们的方法计算方面改编成模块可以访问和远程执行使用Biowulf GNU / Linux的平行p在美国国立卫生研究院 (http://biowulf.nih.gov ) rocessing集群。这种远程访问,与低成本的计算机硬件和高速网络接入相结合,取得了有可能从学校或家中工作的研究人员和学生的参与。
这里介绍的低温电子显微镜和立体的分类和平均方法允许〜20 Å分辨率的包膜糖蛋白复合物的三维结构的测定。 X射线拟合坐标密度图单体组成部分,允许在分子水平上的结构解释。与在开放源码的科学工具和网络基础设施的扩散的发展相结合的低成本计算设备的不断改进使以前难以想象的科学的协作努力。我们采取的这些发展优势,并表明可以在许多年龄的学生达到带来了先进的科学技术。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢艾滋病和癌症的病毒程序,上汽冯检基,公司的生物制品部分,提供纯化,AT – 2治疗的HIV – 1病毒,史蒂芬费里尼和他的同事们利用高性能计算能力的Biowulf的援助Linux集群在国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(http://biowulf.nih.gov) ,飞电子显微镜的帮助公司和Ethan泰勒专家援助与数字。这项工作是由国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达的国家癌症研究所,癌症研究中心的资金支持。
Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil | – | 200 mesh |
Protein A gold colloid | University of Utrech – The Netherlands | – | 10 nm diameter |
HIV-1 BaL | NIH, NCI, Frederick, MD | – | ~ 1011 virions/mL |
Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
Vitrobot Mark III | FEI | – | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | – | 200 keV |
Gatan Imaging Filter | Gatan | – | – |
Gatan Post-GIF CCD | Gatan | – | 2K x 2K pixels |
Gatan Cryo Workstation | Gatan | – | – |
Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | – | Oxygen and Hydrogen plasmas |
C – clips | FEI | ZIT0634 | – |
Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | – | http://biowulf.nih.gov/ |
UCSF Chimera | University of California – San Francisco | – | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
IMOD | University of Colorado – Boulder | – | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
EMAN | Baylor College of Medicine | – | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
RAPTOR | Stanford University | – | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |