Summary
El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera que permite a los investigadores y estudiantes para trabajar a distancia y contribuir al tratamiento de los datos y el análisis estructural.
Abstract
Desde su descubrimiento hace casi 30 años, más de 60 millones de personas han sido infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (www.usaid.gov) . El virus infecta y destruye las células CD4 + células T con ello paralizar el sistema inmune, y causa un síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) 2. La infección comienza cuando la glicoproteína de la envoltura del VIH "pico" se pone en contacto con el receptor CD4 en la superficie de las células T CD4 +. Esta interacción induce un cambio conformacional en el pico, que promueve la interacción con la superficie de una célula segundo co-receptor 5,9. La importancia de estas interacciones de las proteínas en la vía de infección por el VIH los hace de gran importancia en la investigación fundamental el VIH, y en la búsqueda de una vacuna contra el VIH.
La necesidad de entender mejor las interacciones a escala molecular, celular de contacto VIH y neutralización motivado el desarrollo de una técnica para determinar lalas estructuras de la punta del VIH interactúan con las proteínas del receptor de células y las moléculas de superficie que la infección por bloque. Utilizando la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D, hemos demostrado la capacidad de determinar estructuras en la superficie del virus nativo, en la resolución 20 Å ~ 9,14. Este enfoque no se limita a las estructuras de la resolución de la envoltura del VIH, y se puede ampliar a otras proteínas de la membrana viral y las proteínas reconstituidos en un liposoma. En este protocolo, se describe cómo obtener las estructuras de las glicoproteínas de la envoltura del VIH purificada a partir de viriones de VIH y de proceder paso a paso a través de la preparación de muestras vitrificados, la recolección, la crio-microscopía electrónica de datos, la reconstitución y el procesamiento de grandes volúmenes de datos en 3D, con un promedio y clasificar subvolúmenes 3D de proteínas, y interpretación de los resultados para producir una proteína modelo. Los aspectos computacionales de nuestro enfoque se han adaptado a los módulos que se puede acceder y ejecutar de forma remota utilizando el Biowulf GNU / Linux paralela pLABORACIÓN de racimo en el NIH (http://biowulf.nih.gov) . Este acceso remoto, en combinación con hardware de bajo costo y alta velocidad de acceso a la red, ha hecho posible la participación de investigadores y estudiantes que trabajan en la escuela o el hogar.
Protocol
El método descrito aquí se desarrolló con un conjunto específico de instrumentos, herramientas y software. Debido a que todos los laboratorios que no va a utilizar esta configuración experimental misma, se trató de generalizar el enfoque en lo posible, y ofrecer alternativas cuando esto no era posible.
1. Preparación de muestras de virus vitrificado
En la siguiente sección rejillas vitrificado se preparan utilizando la FEI Vitrobot Mark III, un robot caída secante y congelación. Ver Iancu, et al. Para un protocolo detallado sobre el uso de este sistema 7. Como alternativa a un émbolo de robótica, un émbolo de guillotina de estilo o la gravedad es perfectamente suficiente 6.
En las secciones 1.2. y 1.3. un Gatan solarus 950 unidades de descarga luminosa se utiliza para limpiar las rejillas de la muestra y aumentar su hidrofilicidad, a pesar de cualquier dispositivo de descarga luminosa diseñada para usarse con redes de microscopía electrónica puede ser sustituida.
contenido "> A pesar de la cantidad de volumen de la muestra aplicada a la red antes de borrar y la congelación de caída debe estar en el rango de 2 l, el virus y las proteínas-un volumen de oro coloidal en la mezcla de la muestra variará dependiendo de la fuente. Por lo tanto, es probable que una serie de diluciones del virus y el oro o las relaciones que tienen que ser probados y la imagen en el microscopio, y una mezcla ideal determinada empíricamente. Tenga en cuenta que cuando los datos de imagen se adquiere en la Sección 3, entre 10 y 20 de oro marcadores de referencia debe estar presente en la alineación adecuada serie de inclinación.Atención: En esta sección se describe el uso de etano gaseoso, el hidrógeno, y oxígeno, que son altamente inflamables. Las debidas precauciones se deben tomar cuando se utilizan estos gases. Además, se debe tener cuidado al manejar las muestras de virus, de acuerdo con las recomendaciones de bioseguridad. Finalmente, use siempre protección para los ojos y la ropa al manejo de nitrógeno líquido (N 2) y etano.
- Prepare FEI Vitrobot MarcosIII mediante la activación de su suministro de gas N 2, de instalar el cartucho humidificador y después de rellenar el cartucho con agua filtrada destilada. Encienda Vitrobot y establecer su temperatura de la cámara climática a 22 ° C, humedad objetivo al 100%, el tiempo secante a 6 segundos, y borra de compensación a 2 mm.
- Encienda el Gatan solarus 950 unidades de descarga luminosa y abierta H 2 y O 2 latas de que el suministro de la unidad. Pre-cámara de recolección de muestra limpia mediante la ejecución de descarga luminiscente durante 1 minuto a 50 vatios.
- Organizar el número deseado de las redes de carbono perforado en un cubreobjetos de vidrio, de carbono lado, y el lugar dentro de la cámara de descarga luminiscente muestra a través de la puerta de carga superior. Rejillas limpias mediante la ejecución de descarga luminiscente de 6.10 segundos a 25 vatios. (Tenga en cuenta que el lado de carbono de las redes de la marca Quantifoil utilizados en este protocolo se mate en la apariencia. Esto no será válido para todas las redes comerciales lo que es mejor para obtener esta información por parte del fabricante.)
- Coloque la caja de rejilla (es) dentro de cooLant recipiente contenedor, y el eje difusor térmico en la copa central que se encuentra dentro de la taza del líquido de refrigeración. Poco a poco vierta el líquido N 2 en el recipiente hasta que disminuya la fuerte burbujeo, lo que indica el equilibrio entre el recipiente y el líquido. Mantener N 2 líquido nivel durante el resto del procedimiento, teniendo cuidado de mantener fuera de la copa central.
- Conecte un extremo de una manguera de plástico para la bombona de gas etano, y el otro extremo de una pipeta de vidrio. Mantenga punta de la pipeta de vidrio al fondo de la taza central, establecer un flujo lento y constante de etano, etano y se comenzará a condensarse. Continúe llenando hasta la copa central está llena. Retire del husillo de la copa central.
- Preparar la mezcla de la muestra mediante la adición de dos proteínas-A l oro coloidal fiduciales a 10 l AT-2 inactiva el VIH-1 suspensión de virus. Pipeta suavemente la mezcla para que fiduciales en la solución. Mantener en hielo.
- Sujete el borde exterior de una cuadrícula con las pinzas especializadas Vitrobot. Aplicar 2 l de mezcla de la muestra de carbono side de la red. Inmediatamente instrucciones a robot para cargar muestras en cámara húmeda del clima, seque y la congelación de caída de etano líquido.
- Transferencia de la red vitrificado a la caja de la red. Repita el paso 1.7. para producir la cantidad deseada de las redes. Cuando haya terminado, apriete los tornillos de la tapa de caja de rejilla (s) y rápidamente la caja de transferencia (es) a los pequeños de transporte de nitrógeno líquido termo.
2. Cargar las muestras en microscopio electrónico de transmisión
A lo largo de esta sección, el nitrógeno líquido el nivel 2 en la cámara de carga deben ser controlados atentamente, y el líquido reponer cuando sea necesario, para asegurarse de que las cajas de la red permanecen sumergidos. Antes de presentar una herramienta en contacto con una red, que se enfríe por inmersión en nitrógeno líquido hasta que se equilibra 2 con el líquido. Después de cada uso, las herramientas deben ser descongelados con una pistola de aire caliente.
A lo largo de esta sección, el FEI Tecnai G2 Polara microscopio electrónico de transmisión (TEM) se utiliza en conjuncióncon una estación de trabajo Gatan Crio. Aunque el principio de cargar las muestras en nitrógeno líquido condiciones 2 es aplicable a todos los trabajos de crio-microscopía electrónica, los pasos de esta sección son específicas de los equipos utilizados en el experimento. Los pasos que se utilizan para los diferentes equipos pueden variar según el fabricante.
PRECAUCIÓN: En esta sección, siempre use protección para los ojos y la ropa al manejo de líquidos N 2.
- Asegúrese de que Compustage TEM no contiene un cartucho de muestra, y que la selección de las muestras varilla y tubo de inserción están por debajo de 110 K.
- Dejar enfriar y preparar a la estación de trabajo para la carga de las redes de Cryo en el bloque de muestras de almacenamiento, que forma parte de la barra de selección de la muestra.
- Transferencia de la refrigeración (<110 K) la varilla de la selección de microscopio para Cryo estación de trabajo.
- Deslice la barra de selección hacia delante para insertar el bloque de selección en el baño de nitrógeno en la estación de trabajo Crio. Retire todos los cartuchos de muestra de un bloque de almacenamiento que utilizan especializado cartridge manejo de pinzas. Coloque la caja de rejilla (es) en la carga de la estación de trabajo y aflojar la tapa (s) con un destornillador.
- Utilizar pinzas para quitar la red de la caja de rejilla y el lugar en el cartucho. Utilice el especializadas C-clip herramienta de colocación de un depósito C-clip en la parte superior de la red, asegurando la red en el cartucho.
- Repita el paso 2.5. hasta el número deseado de las redes se encuentran en los cartuchos. Transferencia de cartuchos de muestra y selección.
- Prepare la estación de trabajo Cryo para la eliminación de la barra muestra la selección. Deslice la barra de selección de nuevo para quitar el bloque de selección de baño de nitrógeno. Retire la barra de selección de estaciones de trabajo y se adhieren a Cryo TEM.
3. La adquisición de la crio-microscopía electrónica de datos
En esta sección, el FEI lote interfaz de software tomografía se utiliza para crear un archivo por lotes que almacena las coordenadas de todas las posiciones en la parrilla de interés. Cuando se le indique por parte del usuario, el software de la tomografía por lotes volverán a visitar cada una de las posiciones y de coordenadasinclinación de la serie a través de la adquisición Micrografía Digital. Si este software no está disponible, el paquete de software Leginon es viable gratuito, de código abierto alternativo 13. Imágenes se realizó a 200 keV, utilizando un filtro de imágenes Gatan (GIF) con un post-GIF 2K x 2K cámara CCD (Gatan).
- Compustage posición en la que haz de electrones pasa a través del vacío. Cambiar a modo de exposición de alta magnificación (34kX) y realizar alineaciones directa.
- Alinear a cero pico de pérdida de energía del filtro. (Esto proporciona el filtro de la energía con una referencia para los electrones con la pérdida de energía cero.)
- Mueva el Compustage a un área de la cuadrícula con carbono. En bajo aumento (4.5kX) Modo de búsqueda, utilice la función Wobbler para inclinar la etapa de ida y vuelta entre + / -15 °. Mientras tanto, ajustar la posición de la etapa del eje Z hasta cambio de fase mínima se observa. (Esto posiciona el escenario aproximadamente a la altura de eucentric). Wobbler desactivar cuando no hay cambio de fase que se observa.
- Utilice el f automático Altura Eucentric unción para refinar la altura eucentric. (Esta rutina utiliza la correlación cruzada para obtener una altura eucentric más precisa que en el paso 3.3). Altura Eucentric se almacena de forma automática para su posterior consulta por el software de la tomografía por lotes.
- Busque un área de interés con aproximadamente tres a seis viriones, y no menos de diez marcadores de referencia. Añadir esta posición en la parrilla en el fichero de la tomografía por lotes.
- Repita los pasos 3.4. y 3.5. hasta el número deseado de posiciones se designan. Definir los parámetros de proceso por lotes (± 60 ° con incrementos de 2 ° de inclinación, 1-2 electrónico / 2 / ver inclinación) y ejecutar el lote.
4. La reconstrucción de la crio-electrónica de tomografías
- Alinear a la serie de inclinación con fiduciales automática basada en la alineación en un RAPTOR.
- Reconstruir las tomografías con R-ponderada proyección de vuelta en IMOD 8. El formato de archivo estándar para los volúmenes de datos resultante es el archivo de MRC, con extensión de archivo. MRC.
En esta sección se utiliza una extensión personalizada de IMOD, que permite al usuario designar subvolúmenes virión dentro de la tomografía. En la sección 6, el usuario define los límites del virión se utilizan como una superficie a lo largo de los picos que se seleccionan automáticamente.
- Abrir IMOD y la carga de una tomografía poblado de viriones.
- Navegue a lo largo del eje Z de la tomografía hasta el corte central a través de uno de los viriones se encuentra. Verifique que el centro de gravedad del virión ha sido identificado. Después de hacerlo, depósito de un marcador del virión. Este marcador será utilizado por la utilidad de la segmentación automatizada del virión en la Sección 6.
- Continuar designación centroide hasta que todos los volúmenes del virión se identifican.
- Cerca tomografía y guardar conjunto de marcadores que definen centroides virión. Repita hasta que los viriones han sido designados en todas las tomografías.
- Utilizando IMOD, muestra abajo subtomograms virión por un factor de cuatro.
- Viriones eliminación de ruido mediante la más avanzada para mejorar la difusión anisotrópico como se aplica en IMOD.
- Viriones sujeto a la segmentación de la membrana sin supervisión utilizando una energía basada en enfoque tridimensional (detallado en Bartesaghi et al. 2005) 3.
- Picos se identifican en los lugares en la superficie del virión segmentada correspondiente a los máximos locales de la correlación cruzada entre el lugar en particular y una síntesis del volumen simétrico de punta-como. Esos lugares por encima de un umbral determinado se añaden a una lista de coordenadas para putativo subvolúmenes pico.
6. La clasificación y el promedio de las partículas
- Computacionalmente extraer el subvolúmenes tomografía (100 x 100 x 100 voxels) en cada lugar que se identificó en el paso 5.8. (Esto se hace sin eliminación de ruido o de hurgar en la basura). La colección resultante de subvolúmenes contienen las proteínas pico que se clasifican con un promedio en los siguientes pasos.
- Determine las orientaciones del eje de la espiga con la normal a la membrana segmentada automáticamente a la ubicación de cada espiga. Este enfoque proporciona las estimaciones iniciales de dos de los tres ángulos de Euler.
- Selección aleatoria de los otros en lugar de rotación para evitar posibles sesgos en las alineaciones posteriores.
- Aplicar los ángulos de Euler para subvolúmenes, entonces translationally alinear el subvolúmenes a su media cilíndrica promedio mundial para asegurarse de que todos comparten el mismo centro de la masa.
- Eliminar el 10% de subvolúmenes que se correlacionan más mal con el promedio mundial actualizada. Esto se hace para eliminar la densidad de un mayor riesgo de ser erróneamente identificado picos.
- Alinear y clasificar los volúmenes pico sin necesidad de utilizar referencias externas y con la contabilidad adecuada de la cuña que falta (se detalla en Bartesaghi et al. 2008) 4. Progresivamente refinar alineaciones subvolumen y clasificar los volúmenes pico en cada iteración.
- Tres veces la simetría que se observa claramente en las primeras etapas de la clasificación, y en la cuarta iteración, tres veces la simetría es impuesto. En cada ronda, la mayoría de clases bien definidas se promedian y se utiliza como referencia para la siguiente ronda.
- Típicamente ~ 4000 picos deben ser seleccionados para cada conjunto de datos. Mapas finales densidad se obtienen después de rondas de refinamiento ~ 5.12, e incluirá contribuciones de ~ 50% de los sub-volúmenes en cada conjunto de datos.
7. Coordinar la adaptación
- Los mapas de densidad resultante de 6.8 se abren paso en 12 UCSF Chimera.
- Producir una simulación de 20 un mapa de los rayos X coordenadas usando Chimera o EMAN 10.
- Muelle de coordenadas en orientaciones al azar. Utilizando Quimera construido en la optimización de empinada subida-local, en forma coordina mediante la realización de los múltiplos de 100 pasos más empinado ascenso hasta que la convergencia se obtiene.
8. Resultados representante
Usando un promedio 3D y ajuste de coordenadas, una variedad de VIH y SIV estructuras Env pico han sido resueltos. Presenta en la Figura 3A es la estructura de la espiga de sobres de la cepa HIV-1, BAL (morado). El pico tiene tres veces la simetría con unas dimensiones de aproximadamente 120 Å, medida desde la membrana hasta el ápice pico, y una anchura máxima de ~ 150 Å que se estrecha hasta ~ 35 Å en la base de la espiga. Como se observa en la Figura 3B, mediante la combinación del mapa de densidad de trimérica Env determina utilizando la crio-tomografía electrónica con la estructura cristalográfica determinada para gp120 monoméricas (rojo, derivados de la AP ID, 2NY7), hemos sido capaces de obtener un modelo de trabajo molecular para la sobre trimérica complejo glicoproteína (AP ID, 3DNN) 9.
Nuestro enfoque también permite el análisis estructural de los complejos formados entre trimérica Env y una variedad de específicos de la proteína gp120fragmentos y los anticuerpos. Un ejemplo de esto, en el que Env es un complejo con el ampliamente neutralizantes Fab b12 se muestra en la Figura 4 (todo el complejo se muestra en color morado). En esta figura, la densidad adicionales correspondientes a b12 se ve la proyección hacia el exterior de la espiga, y en paralelo a la membrana. Interpretaciones estructurales de complejos de este tipo se puede extender a nivel molecular mediante el ajuste de los mapas de densidad con las coordenadas atómicas de las porciones de la espiga, con destino a la correspondiente ligando. Como se observa en la Figura 4B, cuando este mapa de densidad está equipado con las coordenadas de la proteína gp120 pico (rojo, derivado de AP ID, 2NY7), vinculado por b12 Fab (blanco), las orientaciones relativas de los tres núcleos de la gp120 se pueden distinguir (AP ID, 3DNL). Estas relaciones de conformación son instructivas para comprender cómo interactúan con ligandos como el pico e interferir con la actividad del virus. Algunas otras estructuras de unliganded y liganded Env que han sido resueltos por el método que aquí se presenta include los de VIH-1 R3A, SIV CP-MAC, y SIVmneE11S SIVmac239, el complejo ternario entre el VIH-1 Env Bal, sCD4 y la Fab 17 ter, y SIV Env CP-Mac un complejo con el anticuerpo 7D3 9,14.
Figura 1 de la suspensión viral a la estructura en 3D:. Medidas conceptuales de crio-microscopía electrónica y reconstrucción 3D.
Figura 2. (A) Una porción representativa de una tomografía del VIH-1 viriones. (B) Un solo virión VIH-1, con los picos de núcleo y la superficie se muestra esquemáticamente.
Figura 3. (A) Estructura tridimensional de la glicoproteína de la envoltura del VIH-1 Bal (picos de la superficie) como se muestra en la superficie de la membrana viral. (B) Modelo molecular para la TRIMEpicos ric determinado por la colocación de tres copias de las estructuras de monómeros gp120 (rojo) obtenidas por cristalografía de rayos X en el mapa de densidad de 9.
Figura 4. (A) Estructura tridimensional del VIH-1 glicoproteína de la envoltura BaL en el complejo con el fragmento Fab de un anticuerpo ampliamente neutralizantes, b12. (B) Modelo molecular del complejo determinado por la colocación de tres copias de las estructuras de monómeros gp120-B12 complejo Fab obtenidas por cristalografía de rayos X en el mapa de densidad de 9.
Discussion
La crio-microscopía electrónica y la clasificación en tres dimensiones y los métodos que aquí se presenta un promedio de permitir la determinación de estructuras tridimensionales de complejos glicoproteína de la envoltura de ~ 20 Å de resolución. Instalación de rayos X de coordenadas de los componentes monoméricos de los mapas de densidad permite una interpretación estructural a nivel molecular. Las constantes mejoras en los equipos de computación de bajo costo combinado con la evolución de las herramientas de código abierto científicos y la proliferación de la infraestructura de red hacen posible antes inimaginables esfuerzos de colaboración científica. Tomamos ventaja de estos acontecimientos y demostrar que las técnicas avanzadas de científicos puede ser interpuesto dentro del alcance de los estudiantes de diferentes edades.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sección de Productos Biológicos de la SIDA y del Programa de Cáncer del Virus de la SAIC Frederick, Inc., para proporcionar purificada, AT-2 tratados virus VIH-1, Fellini Steven y sus colegas para obtener ayuda con el uso de las capacidades de computación de alto rendimiento de la Biowulf Linux cluster en el NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI Company para obtener ayuda con la microscopía electrónica, y Ethan Tyler para la asistencia de expertos y cifras. Este trabajo fue apoyado por fondos del Centro para la Investigación del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
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