Summary
协议描述了高通量的方法，以确定使用低温电子断层扫描和三维图像处理的膜蛋白的结构。它涵盖了样品制备的详细信息，数据采集，数据处理和解释，最后一个有代表性的目标的方法，HIV - 1包膜糖蛋白的生产。这些计算程序设计的方式，使研究人员和学生远程工作和作出贡献的数据处理和结构分析。
Abstract
自从近30年前它的发现，超过60万人已经感染了人类免疫缺陷病毒（HIV） （www.usaid.gov） 。该病毒感染和破坏的CD4 + T细胞，从而削弱免疫系统，并造成获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）2。感染开始时，艾滋病病毒包膜糖蛋白“秒杀”接触的CD4 + T细胞表面的CD4受体。这种相互作用引起的构象变化，促进互动与细胞表面受体5,9在穗。在艾滋病毒感染途径的这些蛋白质相互作用的意义，使他们从根本上艾滋病毒研究的深刻重要性，并在追求一种艾滋病疫苗。
需要更好地了解艾滋病毒的细胞接触和中分子尺度的相互作用的动机技术的开发，以确定结构与细胞表面受体的蛋白质和分子，阻止感染艾滋病毒的相互作用穗。使用低温电子断层扫描和三维图像处理，我们最近表现出的能力，以确定对本土病毒的表面，在20〜Å分辨率9,14，这样的结构。这种方法不仅限于解决HIV包膜结构，并可以扩展到其他病毒的膜蛋白和脂质体重组蛋白。在这个协议中，我们描述了如何获取从纯化艾滋病毒的病毒颗粒，进而逐步通过玻璃化冷冻样品的准备，收集，低温电子显微镜数据，重组和3D数据处理量，平均和分类3D蛋白子卷的HIV包膜糖蛋白的结构，并解释结果产生一种蛋白质模型。我们的方法计算方面改编成模块可以访问和远程执行使用Biowulf GNU / Linux的平行p在美国国立卫生研究院 （http://biowulf.nih.gov ） rocessing集群。这种远程访问，与低成本的计算机硬件和高速网络接入相结合，取得了有可能从学校或家中工作的研究人员和学生的参与。
Protocol
这里所描述的方法被开发使用的仪器，工具和软件的具体设置。因为所有的实验室将不会使用这一相同的实验装置，努力作了概括的方法，并在可能的情况下提供替代品，这是不可能的。
1。准备玻璃化冷冻的病毒样本
在下面的部分玻化电网使用费Vitrobot Mark III的一个印迹和暴跌冻结机器人准备。 Iancu， 等上使用这个系统7的详细协议。作为替代机器人柱塞，柱塞断头台式或重力是完全足够6。
在第1.2。和1.3。一个加坦Solarus 950辉光放电单元使用干净的样品网格和提高其亲水性，虽然任何辉光放电装置设计与使用电子显微镜网格可以取代。
内容“>虽然应用于印迹和投身冻结前网格的样本量应在2μL范围内，病毒和混合样品中蛋白- A金胶体量会有所不同，取决于源。因此，很可能是病毒和黄金稀释或比率的范围将进行测试，并在显微镜成像，凭经验确定一个理想的混合物。注意，当图像数据是在第3节获得10和20之间，金基准标记应目前适当倾斜系列对齐。注意：本节介绍的是高度易燃气体乙烷，氢气和氧气的使用。使用这些气体时，应采取适当的谨慎。此外，应小心处理病毒样本，按照生物安全建议。最后，总是穿防护眼镜和衣物时，液态氮（N 2）和乙烷。
- 准备飞Vitrobot马克。第三，通过打开其N 2气体供应，安装加湿器的墨盒，然后填充墨盒过滤的去离子水。 Vitrobot和电源设置其气候室温度22℃，湿度为100％的目标，杂交时间为6秒，和印迹抵销-2毫米。
- 加坦Solarus 950辉光放电单元和开放的H 2和O 2罐，供应单位的电源。运行辉光放电为50瓦1分钟的预清洗标本室。
- 排列的玻璃盖玻片，碳的一面朝上，和辉光放电，通过样品室顶部装载门里面地点上的多孔碳电网所需的数字。清洁电网运行辉光放电6-10秒，在25瓦。 （请注意，在本议定书中使用的Quantifoil品牌电网的碳端是在外观，磨砂，这会不会是所有商业电网的真实，所以最好是从制造商获得此信息。）
- 内首席运营官位发车框（ES）lant容器碗，和中央杯内冷却液碗坐在的热扩散主轴。慢慢倒入碗里的液体氮，直到轰轰烈烈的冒泡消退，表明碗和液体之间的平衡。保持液体N 2平整个过程的其余部分，照顾，以保持中央杯。
- 将塑料软管的一端乙烷气体罐，和一个玻璃吸管的另一端。保持玻璃枪头中央杯的底部，建立一个缓慢的，稳定的乙烷流，乙烷将开始凝结。继续填充，直到中央杯满。从中央杯主轴。
- 准备加入2μL蛋白黄金胶体基准，10μL，AT - 2灭活HIV - 1病毒悬液样品混合物。轻轻吸液管的混合物，使解决方案基准。置于冰上。
- 抓住一个专门Vitrobot镊子的网格的外缘。应用碳小号2μL样品混合物IDE电网。立即指示机器人在液态乙烷的样品装入湿润的气候室，杂交和投身冻结。
- 玻化电网传输到电网中。重复步骤1.7。生产所需数量的电网。当完成后，拧紧螺丝电网盒盖（S），然后快速交接箱（ES）小液氮运输杜瓦。
2。样品载入到透射电子显微镜
在本节中，装载室的液态氮的2级应高度警觉，监测，和液体按需补充，以确保该网格框仍然沉浸。一个工具，使电网接触之前，冷却浸在液态氮 ，直到它与液体达到平衡。每次使用后，工具应使用热风枪解冻。
在本节费Tecnai G2 Polara透射电子显微镜（TEM）一起使用加坦低温工作站。虽然装载样品液态氮条件下的原则是适用于所有的冷冻电子显微镜的工作，本节中的步骤是在实验中使用的设备。针对不同的设备所使用的步骤会有所不同制造商。
注意：在本节中，始终处理液态氮时戴防护眼镜和服装。
- 确保，透射电镜Compustage不包含标本盒，标本选择杆和棒插入低于110 K。
- 冷却和低温工作站准备装入标本存储块，这是样本选择杆的一部分电网。
- 从显微镜的冷却（<110 K）选择杆转移低温工作站。
- 幻灯片选择杆插入氮浴低温工作站选择块。使用专门的彗星从存储块中删除所有标本墨盒artridge处理镊子。位发车盒（ES）装载工作站，用螺丝刀松开盖子（S）。
- 使用镊子取出墨盒网格和地方电网。使用C型夹专门放置工具，沉积在网格上方的一个C夹，确保电网在墨盒。
- 重复步骤2.5。直到所需的格数是在墨盒。标本选择块传输墨盒。
- 准备切除标本选择杆冷冻工作站。将选择杆，以去除氮浴选择块。取出冷冻工作站选择杆和附加到的TEM。
3。收购低温电子显微镜数据
在本节中，飞批次断层扫描软件接口是用来建立一个批处理文件，存储所有感兴趣的发车位置的坐标。当用户的指示，将重新批断层扫描软件的每个岗位，并会协调通过数码显微倾斜的一系列收购。如果这个软件无法使用，Leginon软件包是可行的免费，开源替代品13。成像在200千电子伏，一个加坦成像过滤器（GIF）使用一个后的GIF 2K x 2K分辨率的CCD相机（加坦）。
- 的位置Compustage，这样电子束穿过真空。切换到高放大倍率（34kX）曝光模式，并进行直接的路线。
- 将零能源滤波器的损耗峰。 （这提供与电子零能量损失的参考能源过滤器）。
- 移动的Compustage一个网格区域特色的碳。在低倍率（4.5kX）搜寻模式，使用摇摆功能，来回倾斜+ / -15 °之间的阶段。同时调整，直到最小的阶段转变是观察Z轴的舞台上的地位。 （这个职位eucentric高度约阶段）。禁用摇摆时没有舞台的转变是观察。
- 使用自动Eucentric高度F油膏完善eucentric高度。 （此例程使用交叉相关，以获得更精确的eucentric高度比在步骤3.3）。 Eucentric高度自动存储批量层析成像软件以后参考。
- 查找区，具有约三至六个月的病毒颗粒的利益和不低于10的基准指标。这个发车位置添加到批处理断层扫描文件。
- 重复步骤3.4。和3.5。直到所需的位置数指定。定义批处理参数（± 60 ° 2 °倾斜的增量，1-2 E - / 2 /倾斜视图）和运行批处理。
4。重建的冷冻电子tomograms
- 猛禽1使用自动基准基于对齐，对齐倾斜系列。
- 重建tomograms使用的R -加权反投影的IMOD 8。产生的数据量的标准文件格式是湄公河委员会的文件，文件扩展名。MRC。
本节使用一个定制的IMOD的扩展，允许用户指定范围内的断层扫描病毒颗粒子卷。在第6条，用户定义的病毒粒子的边界是用来作为沿尖峰自动选择表面。
- 打开的IMOD，负载与病毒粒子填充断层扫描。
- 沿Z轴的断层扫描，直到通过中央切片的病毒粒子之一是位于导航。确认，已发现的病毒粒子的质心。这样做之后，存入一个病毒粒子标记。此标记将被用于自动化的病毒粒子在第6分割工具。
- 继续质心的称号，直到所有的病毒粒子卷确定。
- 关闭断层扫描并保存标记集，确定病毒颗粒的重心。重复，直到已在所有tomograms指定的病毒粒子。
- 使用由四个因素的IMOD，羽绒样品病毒粒子subtomograms。
- 使用边缘增强的各向异性扩散降噪病毒颗粒作为实施的IMOD。
- 主题的病毒颗粒无监督膜分割使用能源为基础的三维方法（详见Bartesaghi等，2005）3 。
- 尖峰确定分段病毒颗粒表面的特定位置和合成对称穗状卷之间的交叉相关的局部最大值对应的位置。指定的阈值以上这些位置添加到公认的穗子卷的坐标列表。
6。分类和平均粒子
- 计算提取断层扫描子卷（100 × 100 × 100体素），在每个步骤5.8中确定的的位置。 （这是没有去噪或分级）。结果集合的子卷包含在下面的步骤将分类和平均穗蛋白质。
- ðetermine穗长，正常使用每穗的位置自动分段膜轴的方向。这种方法提供了两个三个欧拉角的初步估计。
- 随机其余就地旋转，以防止任何可能在随后的路线的偏见。
- 应用欧拉角子卷，然后翻译对齐子卷到他们的圆柱形平均的全球平均水平，以确保它们都共享同一中心的质量。
- 删除的子卷的最微弱关联与更新的全球平均水平的10％。这样做是为了清除被错误地确定峰值的风险最大密度。
- 对齐和分类 ，而无需使用外部引用和扣球缺少楔适当的会计（详细Bartesaghi 等人，2008年）4卷。逐步完善子卷的路线，并在每一次迭代分类秒杀卷。
- 应清楚地观察到三倍对称，在分类的早期阶段，并在第四迭代，对称的3倍征收。在每一轮中，最良好定义的类平均，并为下一轮的参考使用。
- 通常〜4000尖峰应选择为每个数据集。 〜5-12细化轮后获得最后的密度图将包括从〜50％，分卷，每个数据集的贡献。
7。坐标拟合
- 步骤6.8密度图是开在加州大学旧金山分校的奇美12。
- 产生一个模拟的20地图上的X射线坐标使用奇美拉或货物舱单10。
- 基座坐标为随机取向。使用奇美拉的建在陡峭的上升局部优化，适合执行100陡峭的上升步骤的倍数，直到获得收敛的坐标。
8。代表性的成果
使用3D平均和协调装修，各种HIV和SIV环境保护尖峰结构已得到解决。图3A是信封尖峰结构的HIV - 1株，BAL（紫色）。秒杀的3倍〜120尺寸测量尖峰尖顶膜的对称性，并锥〜35穗基地的一个最大宽度约150。图3B，三聚环境保护相结合的密度图，确定使用低温电子断层扫描单体gp120的晶体结构（红色，从PDB ID，2NY7派生）确定，我们能够获得一个工作的分子模型三聚体的包膜糖蛋白复合物（PDB ID，3DNN）9 。
我们的方法还可以用于环境保护之间的三聚体和各种gp120的特定蛋白质复合物的结构形成分析片段和抗体。这方面的例子，其中环境保护是具有广谱中和B12的Fab复合物显示在图4A（整复是在紫色所示）。在这个数字中，额外的密度对应B12是从穗向外投射，和平行膜。这种复合物结构的解释，可以延长到分子水平，通过拟合穗的部分，必然要相应的配体，与原子坐标的密度图。图4B，当这个密度图是装有B12晶圆厂（白），三个gp120的核心相对方向的约束坐标gp120的刺突蛋白（红色，从PDB ID，2NY7获得）中可以看出，就可以看出端倪（PDB编号，3DNL）。这些构象关系的理解等配体的相互作用与尖峰和干扰病毒活性的启发。 unliganded和liganded环境保护的一些其他结构已解决方法，包括在这里提出乌兰乌德这些HIV - 1的R3A，SIV病毒的CP - MAC，SIVmneE11S和SIVmac239，HIV - 1巴尔环境保护，sCD4及17B厂之间的三元复合，CP - Mac的环境保护和SIV复合7D3 抗体 9,14 。
图1病毒悬浮的三维结构：在低温电子显微镜和三维重建的概念步骤。
图2（a）从代表的HIV - 1病毒颗粒断层扫描片。 （二）一个单一的HIV - 1病毒颗粒的核心和表面尖峰图示。
图3（A）的HIV - 1 BAL病毒膜表面上显示的包膜糖蛋白（面尖峰）的三维结构。 （二）分子模型的TRIMERIC尖峰由配售单体gp120的X射线晶体学所得密度图9（红色）三种结构的副本。
图4：（一）在复杂的一个广泛的中和抗体Fab片段，B12的HIV - 1 BAL的包膜糖蛋白的三维结构。 （二）为复杂的分子模型，由配售单体gp120的维生素B12厂成密度图9 X射线晶体学派生的复杂结构的三个副本。
Discussion
这里介绍的低温电子显微镜和立体的分类和平均方法允许〜20 Å分辨率的包膜糖蛋白复合物的三维结构的测定。 X射线拟合坐标密度图单体组成部分，允许在分子水平上的结构解释。与在开放源码的科学工具和网络基础设施的扩散的发展相结合的低成本计算设备的不断改进使以前难以想象的科学的协作努力。我们采取的这些发展优势，并表明可以在许多年龄的学生达到带来了先进的科学技术。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢艾滋病和癌症的病毒程序，上汽冯检基，公司的生物制品部分，提供纯化，AT - 2治疗的HIV - 1病毒，史蒂芬费里尼和他的同事们利用高性能计算能力的Biowulf的援助Linux集群在国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达（http://biowulf.nih.gov） ，飞电子显微镜的帮助公司和Ethan泰勒专家援助与数字。这项工作是由国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达的国家癌症研究所，癌症研究中心的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
