Den interstitiella celler Cajal (ICC) är pacemakern cellerna i gastrointestinal (GI) tarmkanalen. De bildar komplexa nätverk mellan glatta muskelceller och postganglionära neuronala fibrer för att reglera GI kontraktilitet. Här presenterar vi immunofluorescens metoder tvärsnitts-och hel-montera visualisering av murina ICC nätverk.
Den interstitiella celler Cajal (ICC) är mesenkymala härrör "pacemaker celler" av gastrointestinala (GI) tarmkanalen som genererar spontana långsamma vågor som krävs för peristaltiken och medla neuronala input från det enteriska nervsystemet systemet1. Olika subtyper av ICC utgör distinkta nätverk i muscularis i mag-tarmkanalen 2,3. Förlust eller skada på dessa nätverk är förenat med en rad motilitetsrubbningar 4. ICC-celler uttrycker KIT receptorn tyrosinkinas på plasmamembranet och Kit immunfärgning har använts för de senaste 15 åren att märka ICC nätverk 5,6. Viktigt är normalt KIT verksamhet som krävs för ICC utveckling 5,6. Neoplastiska omvandlingen av ICC celler resulterar i mag-tarmcancer (GIST), som ofta hamn får-av-funktionen KIT mutationer 7,8. Vi visade nyligen att ETV1 är en släkt-specifik överlevnad faktorn uttrycks i ICC / GIST härstamning och är en mästare transkriptionell regulator behövs för både normala ICC nätverk bildas och för GIST Tumörgenesens 9. Vi visar vidare att den samarbetar med aktiverande KIT mutationer i Tumörgenesens. Här beskriver vi metoder för visualisering av ICC-nät i möss, till stor del bygger på tidigare publicerade protokoll 10,11. På senare tid har kloridkanalen anoctamin 1 (ANO1) också karaktäriseras som en specifik membran markör för ICC 11,12. På grund av deras plasmamembran lokalisering kan immunofluorescens av både proteiner kan användas för att visualisera ICC nätverk. Här beskriver vi visualisering av ICC: s nätverk fast fryst cyrosections och hela förberedelser montera.
Interstitiella celler Cajal var inledningsvis präglats av Santiago Ramóón y Cajal exakt ett sekel sedan med metylenblått och silver kromat fläckar av gastrointestinala muscularis. Cajal trodde initialt ICC-talet var nervceller utifrån sina processer som påminner om axoner och dendriter. Under många efterföljande år har studiet av ICC biologi varit begränsad genom avsaknaden av specifika markörer fram till upptäckten av att KIT inte bara uttrycks i ICC, men också för deras utveckling 6. Sedan dess har KIT immunofluorescens använts i stor utsträckning att studera ICC biologi och har också lett till uppskattning av ICC i andra kontraktila organ såsom urinblåsan. Nyligen har ANO1 identifierats som en andra pålitlig ICC markör.
Det har varit ett flertal publikationer under de senaste 15 åren med hjälp av immunofluorescens för att identifiera ICC med hjälp av olika fixering och montering tekniker. I våra händer "fast fryst" kryosnitt som har prefixet paraformaldehyd och sackaros skyddade verk bäst jämfört med aceton eller paraformaldehyd efter fixering efter cryosectioning. För hela fästen, har vi funnit att aceton fixation följt av slemhinnor dissektion ger den mest robusta resultat.
Historiskt har ACK-2 varit Kit-antikropp i valet för mus ICC identifiering. Det är en råtta monoklonal som erkänner den extracellulära domänen och det är också en blockerande antikropp som orsakar ileus givet att leva möss. Dock är ACK-2 epitopen långsamt förstörs av paraformaldehyd fixering och inte räddas av standardmetoder antigenåtervinning. Vi har funnit att det ACK-4 epitopen är mer motståndskraftig mot paraformaldehyd fixering. Jämfört med fasta frysta block och sektioner, paraffininbäddade block och sektioner bevarar morfologi bättre och är bättre lämpad för långtidslagring (Figur 4). Varken ACK-2 eller ACK-4 har framgångsrikt använts i paraffin. Vi har präglats att D13A2, en ny kanin monoklonal antikropp, fungerar utmärkt i både fast-frusna och paraffin i mag-tarmkanalen.
Kit uttrycks i flera andra celltyper, inklusive melanocyterna, hematopoetiska celler, könsceller, särskilt mastceller, som också finns i mag-tarmkanalen. Lyckligtvis är de flesta mastceller funnit är slemhinnan och inte i muscularis. Dubbel färgning med kanin anti-Ano1 och råtta anti-Kit kan eliminera icke-specifik färgning av varje antikropp (Figur 4). Det är också värt att notera att den relativa uttrycket av Kit och Ano1 mellan subklasser till ICC verkar annorlunda. Till exempel, i tunntarmen, är Kit färgning mycket mer intensivt i myenteric ICC jämfört med ICC i den djupa muskeln plexus medan Ano1 färgning är jämförbar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Cancer Institute (K08CA140946 till YC), (5F32CA130372, till PC), (R01CA102774 och R01HL055748 till PB), försvarsdepartementet (PC094302 till YC), den Shuman Familj fonden för GIST forskning (till PC) och Starr Cancer Consortium (till PC, YC, CLS och PB). Vi vill tacka Katia MANOVA, Ning Fläkt och Mesurh Turkekul av MSKCC molekylär Cytologi core facilitet för hjälp med cryosectioning och immunfärgning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
Animal Feeding Needle | Fisher | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
Blunt Needle | Becton Dickison | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | EM Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |