Summary
이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을 설명합니다
Abstract
Caenorhabditis 엘레간스은 종종 초기 발달 과정 연구의 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 배아, 유전 자원, 그리고 변화의 상대적 용이성의 투명성 C. 만들 자질 아르 조기 embryogenesis을위한 훌륭한 모델을 엘레간스. 레이저 기반 공촛점 현미경과 찬란 라벨 태그는 연구자가 개발 배아의 특정 세포 구조와 단백질을 따르십시오 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 찬란 표시된 염료를 사용하여 같은 lysosomes 또는 mitochondria 같은 특정 organelles을 따를 수 있습니다. 이러한 염료는 성인 생식선에 microinjection에 의해 초기 배아에 전달할 수 있습니다. 또한, 특정 단백질의 지방화는 형광 단백질의 태그를 사용하여 다음 수 있습니다. 예제는 여기에 형광 염료를 사용 lysosomal뿐만 아니라 찬란 태그 히스톤 및 ubiquitin 단백질을 입증 제공됩니다. 분류 히스톤는 DNA를 시각화하기 때문에 세포주기의 단계를 식별하는 데 사용됩니다. GFP - ubiquitin 태그는 초기 배아에서 ubiquitinated vesicles의 역학을 나타낸다. 라벨 lysosomes 및 GFP의 관찰 : ubiquitin는 ubiquitinated vesicles과 lysosomes 사이 colocalization가 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. lysosomal 염료의 microinjection에 대한 기술이 제공됩니다. transgenenic 변종을 생성하기위한 기법 (1, 2) 다른 제공됩니다. 공촛점 현미경이나 회전 디스크 공촛점 현미경 표준 레이저에 시간 경과 현미경 다음 이미징 경우, 태아는 성인 남녀 추니의 nematodes 밖으로 절단되고 2퍼센트 아가로 오스 패드에 장착. 이 방법론은 일찍 embryogenesis의 높은 해상도 시각화를 위해 제공합니다.
Protocol
1. 선충류 문화
- 해당 C.를 구합니다 엘레간스는 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료로부터 변형.
- OP50 박테리아 론 (3) 씨앗 NGM 한천 플레이트에 nematodes 성장. 25 GFP 종자 성장의 분석 ° C 권장합니다.
- 당신의 현미경 실험 전날는 씨앗을 품고 접시에 최소한 40 L4 유충을 선택하고 ° C 야간 25 접시를 놓습니다. 이 벌레는 실험을 위해 젊은 성인 것입니다.
2. 주사
이 같은 lysosomes이나 mitochondria와 같은 구조를 볼 수 바람직 경우, 성인 시각화하기 전에 형광 색소를 주입 수 있습니다.
- 마른 아가로 오스 사출 패드를 준비합니다. (이것은 사전에 많은 일을 할 수 있습니다)
- 물에 녹은 2% 아가로 오스를 준비합니다. 파스퇴르 피펫으로 22X54 mm의 coverglass에 2 방울을 넣어. 드롭 위에 교차 현명한 다른 coverglass를 놓습니다. 패드의 직경이 약 1.5 cm 때까지 적절한 두께를 달성하기 위해 상단 coverglass에서 누르십시오. 50~10분 위해 앉아 보자.
- 최고 coverglass를 제거합니다. 1 시간 동안 80 ° C 오븐에 넣어하여 아가로 오스 패드를 탈수 또는 특급 benchtop 앉을 수 있습니다.
- Mitotracker 또는 Lysotracker 솔루션을 준비합니다.
- 에그 버퍼에 형광 에이전트를 희석. 우리는 일반적으로 Mitotracker 또는 Lysotracker의 1시 10분 희석을 사용합니다.
- 주사 바늘은 1.2 OD의 유리 모세관에서 이루어집니다. 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 당기세요.
- 다시 희석 염료로 바늘을 채우기 위해 뽑아 Pastuer의 pipet을 사용합니다.
- 사용까지 가벼운 무료, humidified 챔버에 넣어 바늘.
- 사전 사출 : 현미경과 주사 바늘을 설정합니다.
- 분사 장치에 마운트 주입 바늘. 우리기구는 DIC 이미징 기능을 갖춘 니콘 TE200 거꾸로 현미경의 무대에 탑재 Narishige 직접 드라이브 micromanipulator입니다.
- 압력 조절기에 연결된 1.2 mm ID를 튜브에 바늘을 연결합니다. 압축 공기 또는 질소 중은 외부 압력 소스로 사용할 수 있습니다. 레귤레이터 20-25 PSI로 설정합니다.
- 사출 패드에 무거운 광유 (Parafin 기름) 대신 2 방울.
- 현미경에 사출 패드를 놓고 기름에 바늘을 낮추십시오. 압력이 적용되었을 때 바늘에서 자유롭게 있는지 유체 흐름을 확인합니다. 사출 압력을 적용하고 액체가 바늘 밖으로 흐르는지를 관찰합니다. 그렇지 않다면, 당신은 부드럽게 바늘의 끝을 휴식이 필요합니다. 주사 바늘을 부드럽게 사출 패드에 위치 깨진 coverglass의 작은 조금에 팁을 운전하여 고장 수 있습니다. 바늘이 흐르는되면 다음 단계로 이동하십시오.
- 사출.
- 이전보기 배아로 약 1 시간, 사출 패드에 오일 드롭으로 젊은 성인 벌레를 전송할 수 있습니다. 해부 현미경을 사용하여 전송을 수행합니다. 전송 벌레에 대한 뾰족한 팁있는 플래티넘 와이어 웜 선택을 사용합니다.
- 그들은 패드에 직접 누워 수 있도록 10 웜 - 3 정렬. 사출 들어, 그것은 쉬운되는 웜은 서로 평행 줄지어하고 좀 덜 이상의 웜 길이 떨어져.중인 경우 벌레가 사출 패드에있는되면 신속하게 작업하고 웜은 탈수에서 멸망하기 전에 분사 과정을 완료하는 것이 중요합니다.
- 사출 현미경의 현미경 단계에 벌레로 coverglass를 놓습니다. 말초 생식선 튜브의 중앙 부분 (rachis)에 중점을두고 있습니다. 그런 다음 동일한 초점 비행기로 바늘의 팁을 이동 micromanipulator를 사용합니다. 수평 그래서 벌레가 바늘로 구멍되는 단계로 이동합니다. 바늘 끝이 rachis 내부되면, 압력을 적용하고 생식선이 염료 혼합물로 작성하실 수 있습니다. 사출 패드에있는 모든 벌레의 생식선 무기를 모두 주사.
- 주사 후, 벌레에 계란 버퍼의 0.5 ML를 제공하기 위해 가져온 파스퇴르 pipet을 사용합니다. 이것은 탈수의 죽음에서 그들을 유지하고 그들 사출 절차에서 복구하실 수 있습니다.
- 벌레가 빛을 무료 humidified 챔버에서 실온에서 1~2시간에 대한 복구를 허용합니다.
3. 배아를 볼 아가로 오스 패드
- 에그 버퍼에서 용융 2% 아가로 오스를 준비합니다.
- 파스퇴르 pipet으로 깨끗한 현미경 슬라이드에 용융 아가로 오스 3 방울을 넣어.
- 그들을 취재 테이프를 라벨링 한 계층을 두 가지 다른 슬라이드 사이에 슬라이드. 다음은 아가로 오스의 패드가 올바른 두께 있는지 확인합니다 스페이서 역할을합니다.
- 수직 아래로 아가로 오스 방울에 두 번째 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 상단 슬라이드 가이드 슬라이드에서 테이프에 달려 때까지 누르십시오.
- 이 관찰을 위해 배아를 탑재 준비 직전에, 상단 슬라이드를 제거합니다.
- 벌레가 주입되지 않은 경우, 다음 두 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 그들을 건너 뛰십시오.
- 전날 준비했던 접시에서 젊은 성인 웜을 선택합니다. 당신은 젊은 성인 안에 배아를 볼 수 있어야합니다.
- unseeded NGM 플레이트에 50-20 벌레를 선택하십시오. 벌레들에게 붙어있는 박테리아의 대부분을 잃게 될 수 있도록 벌레가 몇 분 동안 unseeded 접시 주위에 크롤 링을 허용합니다.
- 어른 벌레의 젊은 배아를 얻습니다
- 18mm 2 글라스 coverglass (1.5 coverglass 두께가 바람직합니다)의 중간에 에그 버퍼의 5-20 μl 드롭 놓습니다.
- 에그 버퍼의 드롭에 unseeded 판이나 사출 패드에서 벌레를 이동합니다.
- 26 게이지 바늘로 피하 오픈 웜 컷. 외음부 근처의 벌레를 엽니다 컷. 이 배아는 웜의 흐르다가 나타납니다.
- 현미경 슬라이드에 마운트
- 아가로 오스 패드와 함께 준비하고 태아와 coverglass에 그것을 낮은 현미경 슬라이드 반전.
- 오랜 시간의 경과가 필요한 경우, dessication을 방지하기 위해 coverglass의 가장자리를 밀봉하기 위해 석유 젤리를 사용합니다.
5. 현미경 사용법
- 해당 배아 찾기.
- 현미경 단계에 플레이스 슬라이드. 배아를 찾을 10X 렌즈와 스캔.
- 초기 단계의 배아를 찾으려면, 산모 감수 분열을 작성하는 과정에있는 배아를 검색합니다. 그들이 단축 공사를하지 않았기 때문에 Meiotic 배아는 나중에 태아에서 구별하실 수 있습니다. (배아는 세포의 감수 분열을 마친 후 앞쪽에 끝에있는 세포막과 알 껍질 사이에 큰 차이를 볼 수 있습니다.)
- 일단 확인이 적절하게 embryogenesis의 기록에 대한 높은 배율 렌즈 이동, 배아를 개최.
- 이미징
- 이 예제에서, 우리는 mCherry을 표현 배아를 상상하고 있습니다 : H2B 및 GFP : UB 태그 단백질. 우리는 자이스 혈구 LSM700 기존의 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 있습니다.
- 이미지는 63X 1.4NA 렌즈를 사용하여 수집하고 있습니다. 488과 555 레이저는 최소한의 레이저 전원과 최대 이득과 함께 사용됩니다. AZ 스택은 모든 10-15초를 수집합니다. photobleaching의 범위에 따라 30-60 시간 포인트를 수집하고 있습니다. Z 스택 이미지는 최종 시간 경과 영상에 대한 최대 투사 이미지로 붕괴됩니다.
6. 대표 결과 :
그림 1. C. 최초 유사 분열을 수정 엘레간스.
그림 2. Microinjection 절차.
보충 비디오 1 GFP의 시간 저속 비디오 :.. meiotic 배아에서 ubiquitin 플러스 Lysotracker 블루 비디오를 보려면 여기를 누르십시오.
Discussion
정자와 융합 후, 접합자는 동적 이벤트의 시리즈를 겪습. 이러한 이벤트는 급속히 발전 배아에 상대적으로 정적 세포에서 oocyte를 변환. 많은 생물에서 세포질 rearrangements는 배아 극성을 수립 및 계란 활성화를 위해 중요하다. C. 엘레간스의 배아는 난자의 활성화 및 embryogenesis 이러한 초기 이벤트를 관찰 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 수정 후 비교적 빠른 속도로 난자는 투명하고 초기 개발 이벤트가 발생합니다. C.가 엘레간스 연구팀은 찬란 초기 개발에 참여 표시된 단백질을 표현하는 많은 유용한 유전자 변형 종자를 생성합니다. RNAi 또는 돌연변이와 함께 이러한 변종을 사용하면 다세포 유기체의 개발 (5, 6, 7, 8) 기초 분자 경로를 해부위한 강력한 시스템을 제공합니다. 이 동영상이 문서에서는 C. 일찍 embryogenesis 동안에 이벤트를 기록하기 위해 이러한 도구와 기술을 사용하는 실용적인 접근 방식을 제시 엘레간스.
성숙 C. 엘레간스의 oocyte는 감수 분열 I의 prophase에서 체포되고 성인 남녀 추니의 spermatheca에 수정된 것입니다. 수정 후, oocyte는 감수 분열 I 및 II의 나머지 단계를 진행. 이러한 단계는 찬란 분류 히스톤 H2B (5)를 사용하여 볼 수 있습니다. 산모 감수 분열이 완료하는 동안 정자의 DNA는 (그림 1 참조) 응축 남아 있습니다. 감수 분열의 완성 후, 모자 아버지 DNA는 decondensed와 두 pronuclei 양식이됩니다. 산모 pronucleus은 그런 아버지 pronucleus 대한 마이 그 레이션 그리고 그들은 배아의 중앙 근처에 함께 참여합니다. 유사 분열 신속하게 pronuclear 회의 후 ensues. 이 모든 일들이 시간 안에 발생합니다. 따라서 이벤트의 순서의 시간 경과 현미경을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 것은 공촛점 현미경에 대한 액세스 이외에 선충류의 culturing뿐만 아니라 기본적인 현미경 기술의 특정 시설이 필요합니다.
여기에 제시 예제는 유전자 변형 C.을 활용 : ubiquitin과 mCherry : : : H2B이 형광 단백질, GFP를 표현 엘레간스 변형. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경은 두 단백질의 역동적인 현지화을 관찰하는 데 사용됩니다. 또한, 우리는 찬란 분류 Lysotracker의 주입은 수정 후 배아의 lysosomes의 운명을 수행하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 라벨 추적 장치의 분사도 mitochondria 또는 지방 칼슘 농도 (9)의 시각화를 위해 수행할 수 있습니다. 이론적으로, 사출 프로토콜은 배아의 찬란 분류 분자의 모든 종류를 볼 사용할 수 있습니다. 이 표시된 작은 분자, 단백질, lipids 등 일부의 경우를 포함할 수 있습니다, 그것은 실제로 벌레가 쉽게 이해 등 mitotracker (10) 같은 염료를하므로 레이블 추적기를 주입 필요하지 않을 수 있습니다. 그러나, 우리는 몸으로 및 lysotracker의 주입을 모두 시도하고 배아의 시각화를 위해 사출과 함께 훨씬 더 나은 결과를 발견했다.
기술 고려 사항 :
이 절차가 나타 기술적 과제는 microinjection 기술뿐만 아니라 영상에 어려움을 아주 초기 배아를 포함합니다. microinjections에 대해서, 아가로 오스 분사 패드의 두께가 성공적으로 주사를 위해 중요합니다. 패드가 너무 두꺼운 경우 벌레가 dessicate 신속하게 죽을 것이다. 패드가 너무 얇은 경우에는 벌레가 사출 과정에서 패드에 집중하지 않습니다.
초기 배아는 온도와 버퍼 조건으로 환경 조건에 민감 수 있습니다. 와일드 타입 배아는 정자의 DNA와 세포의 감수 분열 II (4) 완성 분 정도 이내 pronuclear 이주 decondensation를 시작합니다. 20 분 내에, 첫번째 cytokinesis 시작한다. 배아가 매우 높은 레이저 강도에 노출되거나 과열되거나 설치 중에 깔린 경우,이 프로세스가 중단될 수 있습니다. 이러한 배아 개발을 체포합니다. 이 문제가 발생하면, 실험은 감소 레이저 전원 또는 두꺼운 아가로 오스 패드와 반복해야합니다.
C. 엘레간스의 배아가 곧 수정이 끝날 때까지 자신의 알 껍질을 분비하지 않습니다. 수정 및 계란 껍질의 분비 사이의 짧은 시간 동안, 태아는 어머니 (11) 이외의 가능한되지 않습니다. 일부 실험실은. utero의 영상 배아 (5, 12)에 의해이 문제를 피할 수 있었을 utero에 이미지는 수정 중에 또는 이후에 발생하는 이벤트를 캡처하는 능력과 같은 특정 혜택을 제공합니다. 그러나,이 기술은 깊은 조직 이미징을 허용 현미경 시스템의 사용을 필요로합니다. 이러한 두 광자 또는 다중 광자와 같은 시스템은 특히이 (13, 14)에 적합합니다. 종래의 레이저가 - 스캔 또는 디스크 공촛점 현미경을 회전, 최고의 이미지는 배아에서 얻은 것을 헥타르를 사용할 때여기에 설명된하신 성인 웜 잘라되었습니다.
이미징 시스템 고려 사항 :
사용 공촛점 이미징 시스템의 유형은 사용자의 요구에 따라 달라집니다. 한 소원이 가능한 가장 높은 해상도의 이미지를 얻기위한 경우 일반적으로 레이저 스캔 시스템은 좋습니다. 이미지 수집가 비교적 신속하고 photobleaching / phototoxicity가 감소로 한편, 회전 디스크 시스템은 더 높은 동적 이미징 프로세스에 적합합니다.
특정 영상 매개 변수는 실험 설계 및 고용 공촛점 이미징 시스템에 따라 달라집니다. 다차원 영상에서, 하나는 수집 채널, 초점 비행기, 그리고 시간이 지점의 수를 고려해야합니다. photobleaching 및 phototoxicity의 제한 효과로 인해, 이미지의 유한 번호는 특정 실험에서 취득하실 수 있습니다. 당신이 취득하는 채널의 수를 늘리기 위해 선택하는 경우 따라서, 당신은 가능성이 초점 비행기 및 / 또는 시간 지점과 반대의 수를 줄이기 위해 필요합니다. 획득 수있는 이미지의 총수는 물론 사용중인 공촛점 현미경의 감도로 몇 군데되는 형광단의 강도에 의해 영향을받습니다. 더 강렬 fluorophores 더 민감한 악기 짧은 노출 시간을 필요로하기 때문에 적은 photobleaching 및 phototoxicity을 생산합니다.
다수 또는 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다. 우리는 우리 자신의 실험실에서 사용되고있는 시스템에 대한 자세한 내용을 제공할 것입니다. 디스크 공촛점 현미경을 회전하여 영상 웜 배아 위해, 우리는 계획 APO 목표를 NA 60X/1.4 장착된 니콘 TE2000U 거꾸로 현미경을 사용합니다. 현미경은 요코 CSU10 회전 디스크 장치, 하마 마츠 C9100 - 13 EM CCD 카메라, 그리고 스펙트럼 적용 연구 LMM5 레이저 병합 모듈 405에서 출력없이 네 고체 레이저를 포함, 491, 561 및 655 nm의 연결되어 있습니다. 이 시스템을 사용 우리는 하나 또는 두 개의 채널 6-12 초점 비행기, 그리고 25-50 timepoints을 (30~60초 간격) 캡처할 수 있습니다. 전형적인 노출 시간 100 200 밀리초입니다.
레이저 공촛점 현미경을 스캔 이미징 배아 위해, 우리는 2 채널과 네 개의 고체 레이저 (405 488, 555 및 635 nm의)이 장착된 자이스 혈구 LSM700을 사용합니다. 이 제도는 배아 이미징에 사용되는 계획 - APO 63X/1.4NA의 목적으로 자이스 혈구 Axio 관측기 거꾸로 현미경에 첨부되어 있습니다. 또한이 시스템은 제한된 영상 처리 및 분석 서비스를 제공합니다 이미지 수집을위한 자이스 혈구 선종 소프트웨어를 사용합니다. 이 fluorochromes과 이미징, 우리가 일반적으로 1-5 초점 비행기를 (따로 ~ 0.5 μm의) 수집 및 Z 스택에게 15 초마다를 수집할 경우. 중요한 photobleaching가 발생되기 전에 컬렉션이 계속됩니다. 최종 시간 경과 비디오를 생성하려면, Z 스택 이미지는 선 소프트웨어의 최대 투영 도구를 사용하여 통합하고 있습니다. 동영상은 AVI 파일과 소프트웨어 수출하고 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 국립 보건원 (R15 LB에 GM065444 - 03)과 건강 (NIH)과 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소 (KO)의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에서 자금을 인정하고 싶습니다. NSF 수상 (DBI - 0923402)는 LSM700 공촛점 현미경의 인수를 투자. 우리는 또한 일반적인 지원과 박사 앤디 황금의 원고에 대한 유용한 의견을 인정하고 싶습니다. 신용 공유 자원, 프로토콜 및 아이디어에 대한 전체 C. 엘레간스 커뮤니티로 이동합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg Buffer | 5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2 | ||
| Mitotracker | Invitrogen | M-7512 | |
| Lysotracker | Invitrogen | L-7525 | |
| Injection Capillary Pipet | Harvard Apparatus | GC120F-10 | |
| Needle Puller | Kopf Instruments | Model 700C | |
| Microinjector Apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 microinjection regulator |
References
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