I artikeln beskrivs en teknik för visualisering av de tidiga händelserna embryogenesen i rundmasken<em> Caenorhabditis elegans</em>.
Caenorhabditis elegans har ofta använts som modellsystem i studier av tidiga utvecklingsprocesser. Öppenheten i embryon, de genetiska resurserna, och relativt lätt att omvandlingen är egenskaper som gör C. elegans en utmärkt modell för tidig fosterutveckling. Laserbaserade konfokalmikroskopi och fluorescerande taggar låta forskare att följa särskilda cellulära strukturer och proteiner i det växande embryot. Till exempel kan man följa specifika organeller som lysosomer eller mitokondrier, med hjälp av fluorescerande färgämnen. Dessa färgämnen kan levereras till det tidiga embryot genom mikroinjektion i vuxen gonad. Dessutom kan lokalisering av specifika proteiner följas med hjälp av fluorescerande proteinet taggar. Exempel presenteras här visar användningen av ett fluorescerande lysosomala färgämne samt fluorescerande taggade histon och ubiquitin proteiner. Den märkta histon används för att visualisera DNA och därmed identifiera skede av cellcykeln. GFP-märkta ubiquitin avslöjar dynamik ubiquitinated blåsor i det tidiga embryot. Observationer av märkt lysosomer och GFP:: ubiquitin kan användas för att avgöra om det finns colocalization mellan ubiquitinated blåsor och lysosomer. En teknik för mikroinjektion av det lysosomala färgämne presenteras. Tekniker för att generera transgenenic stammar presenteras på annat håll (1, 2). För bildkommunikation, är embryon skärs ut av vuxna hermafrodit nematoder och monteras på 2% agaros kuddar följt av tidsförlopp mikroskopi på en standard laserskanning konfokalmikroskop eller en snurrande skiva konfokalmikroskop. Denna metod ger den höga upplösningen visualisering av tidig fosterutveckling.
Efter fusion med spermierna genomgår zygot en rad dynamiska händelser. Dessa händelser förvandla äggcellen från en relativt statisk cell till den snabbt växande embryot. I många organismer, cytoplasmisk omflyttningar är kritiska för att skapa embryonala polaritet för ägg och aktivering. C. elegans embryo ger ett utmärkt tillfälle för att observera dessa tidiga händelser ägg aktivering och fosterutveckling. Embryot är transparent och tidiga utveckling händelser inträffar relativt snabbt efter befruktning. C. elegans forskare har genererat många användbara transgena stammar som uttrycker fluorescerande proteiner involverade i tidiga utveckling. Med hjälp av dessa stammar tillsammans med RNAi eller mutanter ger ett kraftfullt system för att dissekera de molekylära vägar som ligger bakom utvecklingen av en flercellig organism (5, 6, 7, 8). Denna video artikeln presenteras ett praktiskt sätt att använda dessa verktyg och tekniker för att spela in händelser under tidig embryogenes i C. elegans.
Den mogna C. elegans äggcell blir arresterad i profas av meios I och befruktas i spermatheca av den vuxna hermafrodit. Efter befruktningen, äggcellen fortsätter genom resten av meios I och II. Dessa stadier kan observeras med hjälp av fluorescerande histon H2B (5). Under slutförandet av moderns meios förblir spermiens DNA kondenserade (se figur 1). Efter slutförandet av meios, blir moderns och faderns DNA decondensed och de två pronuclei formuläret. Moderns pronucleus vandrar mot faderliga pronucleus och de förenas nära mitten av embryot. Mitos inträder snabbt efter pronuclear möte. Alla dessa händelser inträffar i mindre än en timme. Således kan tidsförlopp mikroskopi av detta händelseförlopp lätt utföras. Utföra denna teknik kräver vissa anläggningen i nematoden odling samt grundläggande färdigheter mikroskopi förutom tillgång till ett konfokalmikroskop.
Exemplet som presenteras här utnyttjar en transgen C. elegans stam som uttrycker två fluorescerande proteiner, GFP:: ubiquitin och mCherry:: H2B. En konfokala laserskanning mikroskop används för att observera den dynamiska lokalisering av dessa två proteiner. Dessutom visar vi att injektion av fluorescerande Lysotracker kan användas för att följa öde lysosomerna i embryot efter befruktningen. Injektion av en märkt TRACKER kan också utföras för visualisering av mitokondrier eller lokala kalcium koncentrationer (9). I teorin skulle injektionen protokollet användas för att visa alla typer av fluorescerande molekyl i embryot. Detta kan inkludera märkt små molekyler, proteiner, lipider, etc. I vissa fall kan det inte vara nödvändigt att faktiskt injicera märkt trackers som maskar kommer lätt upptaget vissa färgämnen som mitotracker (10). Men vi har provat både blötläggning och injektion av lysotracker och har hittat mycket bättre resultat med injektion för visualisering i embryon.
Tekniska överväganden:
De tekniska utmaningarna med detta förfarande ingår mikroinjektion teknik samt svårigheten att avbildning mycket tidiga embryon. När det gäller microinjections är tjockleken på agarosen injektion pad avgörande för framgångsrika injektioner. Om plattan är för tjock, kommer maskar dessicate och dör snabbt. Om plattan är för tunn, kommer maskarna fastnar på plattan under injektionen processen.
De tidiga embryon kan vara känsliga för miljöfaktorer som temperatur och buffert. Vildtyp embryon bör ta initiativ till decondensation av spermiens DNA och pronuclear migration inom en minut eller så för att slutföra meios II (4). Inom 20 minuter ska den första cytokines börja. Om foster exponeras för mycket höga laser intensitet eller är överhettad eller krossas under montering, kan denna process störas. Sådana embryon kommer att arrestera utveckling. Om detta inträffar bör försöket upprepas med minskad laser makt eller en tjockare agaros pad.
C. elegans embryon inte utsöndrar inte sina äggskal till strax efter befruktningen. Under den korta tiden mellan befruktningen och sekretion av äggskal, embryon inte är livskraftiga utanför moderns (11). Vissa laboratorier har undvikit denna utmaning genom avbildning embryon i livmodern (5, 12). I livmodern imaging ger vissa förmåner som möjlighet att fånga händelser som inträffar under eller strax efter befruktningen. Detta kräver dock att tekniken att använda en mikroskopi system som möjliggör djup vävnad avbildning. System som två-photon eller flera foton är speciellt lämpade för detta (13, 14). När du använder en vanlig laser-scanning eller spinning disk konfokalmikroskop, är de bästa bilderna från embryon som hahar varit klippa ut av den vuxna masken som beskrivs här.
Imaging System tänka på:
Den typ av konfokala används Imaging System beror på användarnas behov. I allmänhet är laserskanning system rekommenderas om man vill få bilder med högsta möjliga upplösning. Å andra sidan är spinning disk system som är bättre lämpade för bildbehandling mycket dynamiska processer som bild förvärvet är relativt snabb och fotoblekning / fototoxicitet minskar.
De specifika imaging parametrar varierar beroende på den experimentella designen och konfokala Imaging System anställda. I flerdimensionella avbildning, måste man överväga det antal kanaler, fokalplan, och tid-punkter samlas in. På grund av att begränsa effekterna av fotoblekning och fototoxicitet kan ett ändligt antal bilder kan förvärvas i en viss experiment. Således, om du väljer att öka antalet kanaler som skall förvärvas, kommer du sannolikt att minska antalet fokalplan och / eller punkter tid och vice versa. Det totala antalet bilder som kan förvärvas kommer att påverkas av intensiteten i fluoroforen som avbildas liksom känslighet konfokalmikroskop som används. Mer intensiva fluoroforer och känsligare instrument kommer att kräva kortare exponeringstider och därmed producera mindre fotoblekning och fototoxicitet.
Ett stort antal eller system avbildning finns. Vi kommer att ge detaljer om de system som har använts i våra egna laboratorier. För embryon avbildning masken genom att snurra disk konfokalmikroskopi, använder vi en Nikon TE2000U inverterat mikroskop utrustat med en 60X/1.4 NA Plan Apo mål. Mikroskopet är ansluten till en Yokogawa CSU10 spinning disk enhet, en Hamamatsu C9100-13 EM CCD-kamera, och en Spectral tillämpad forskning LMM5 laser samman modul som innehåller fyra fasta tillståndets lasrar med utgång på 405, 491, 561 och 655 nm. Med detta system kan vi ta en eller två kanaler, 6-12 fokalplan, och 25 till 50 tidpunkter (vid 30 till 60 sekunders intervall). En typisk exponeringstiden är 100 till 200 millisekunder.
För avbildning embryon med laserscanning konfokalmikroskopi, använder vi en Zeiss LSM700 utrustad med 2 kanaler och fyra fasta lasrar state (405, 488, 555 och 635 nm). Detta system är kopplat till en Zeiss Axio Observer inverterat mikroskop med en Plan-Apo 63X/1.4NA mål för embryo avbildning. Systemet använder Zeiss ZEN programvara för bild-förvärvet, som också ger begränsad bildbehandling och analys. Vid avbildning med två fluorokromer, vi brukar samla 1-5 fokalplan (~ 0,5 mm mellanrum) och samla in ett Z-stack var 15 sekund. Samlingar är fortsatt tills signifikant fotoblekning har skett. För att generera den slutliga tidsförlopp video, är Z stapla bilder konsolideras med maximal projektion verktyg i ZEN programvaran. Videoklipp som exporteras från programvaran som avi-filer.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för finansiering från National Institutes of Health (R15 GM065444-03 till LB) och Interna forskningsprogram National Institutes of Health (NIH) och National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar (KO). En NSF utmärkelse (DBI-0.923.402) finansierade köpet av LSM700 konfokalmikroskop. Vi vill också att erkänna allmänt stöd till och hjälpsamma kommentarer om manuskriptet från Dr Andy Golden. Credit går till hela C. elegans community för att dela resurser, protokoll och idéer.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Composition |
---|---|---|---|
Egg Buffer | 5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2 | ||
Mitotracker | Invitrogen | M-7512 | |
Lysotracker | Invitrogen | L-7525 | |
Injection Capillary Pipet | Harvard Apparatus, Kent, UK | GC120F-10 | |
Needle Puller | Kopf | Model 700C | |
Microinjector Apparatus | Tritech Research | MINJ-1 microinjection regulator |