Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Summary

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de nematode

Abstract

Caenorhabditis elegans is vaak gebruikt als een modelsysteem in studies van de vroege ontwikkelingsprocessen. De transparantie van de embryo's, de genetische hulpbronnen, en het relatieve gemak van transformatie zijn kwaliteiten die C. maken elegans een uitstekend model voor vroege embryogenese. Op laser gebaseerde confocale microscopie en fluorescent gelabelde labels kunnen de onderzoekers de specifieke cellulaire structuren en eiwitten te volgen in de zich ontwikkelende embryo. Bijvoorbeeld, kan men volgen specifieke organellen, zoals lysosomen of mitochondriën, met behulp van fluorescent gelabelde kleurstoffen. Deze kleurstoffen kunnen worden geleverd aan de vroege embryo door middel van micro-injectie in de volwassen gonade. Ook kan de lokalisatie van specifieke eiwitten worden gevolgd met behulp van fluorescerende proteïne tags. Voorbeelden zijn die hier demonstreren het gebruik van een fluorescente kleurstof lysosomale evenals fluorescent gelabelde histon-en ubiquitine eiwitten. De gelabelde histon wordt gebruikt om het DNA te visualiseren en daarmee het stadium van de celcyclus te identificeren. GFP-gelabelde ubiquitine onthult de dynamiek van de geübiquitineerde blaasjes in de vroege embryo. Waarnemingen van gelabelde lysosomen en GFP:: ubiquitine kan worden gebruikt om te bepalen of er colocalization tussen geübiquitineerde blaasjes en lysosomen. Een techniek voor de micro-injectie van de lysosomale kleurstof wordt gepresenteerd. Technieken voor het genereren van transgenenic stammen worden elders gepresenteerd (1, 2). Voor de beeldvorming, worden embryo's uitgesneden van volwassen hermafrodiet nematoden en gemonteerd op 2% agarose pads, gevolgd door time-lapse microscopie op een standaard laser scanning confocale microscoop of een draaiende schijf confocale microscoop. Deze methode biedt voor de hoge resolutie visualisatie van de vroege embryogenese.

Protocol

1. Nematode culturen

1. Het verkrijgen van de juiste C. elegans stam van de Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) of van een collega.
2. Grow aaltjes op NGM agarplaten bezaaid met een OP50 bacteriële grasveld (3). Voor de analyse van GFP stammen groei bij 25 ° C wordt aanbevolen.
3. De dag voor uw microscopie experiment, pick ten minste 40 L4 larven op gezaaid borden en leg de platen bij 25 ° C gedurende de nacht. Deze wormen zullen worden jonge volwassenen voor het experiment.

2. Injecties

Als het wenselijk is om structuren zoals lysosomen of mitochondriën bekijken, kunnen volwassenen worden geïnjecteerd met een fluorescerende kleurstof voorafgaand aan de visualisatie.

1. Bereid gedroogde agarose injectie pads. (Dit kan gedaan worden een tot vele dagen van tevoren)
   1. Bereid gesmolten 2% agarose in water. Met een Pasteur pipet twee druppels op een 22X54 mm dekglaasje. Plaats een dekglaasje kruiselings op de top van de drop. Om de juiste dikte te bereiken, drukt u op de top dekglaasje tot aan de diameter van de pad is ongeveer 1,5 cm. Laat zitten voor 5-10 minuten.
   2. Verwijder de top dekglaasje. Uitdrogen van de agarose pad door deze in een 80 ° C oven gedurende 1 uur of een nacht laten staan ​​zitten benchtop.
2. Bereid Mitotracker of Lysotracker oplossing.
   1. Verdunnen TL-agent in Egg Buffer. We gebruiken meestal een 1:10 verdunning van Mitotracker of Lysotracker.
   2. De injectie naald is gemaakt van een 1,2 OD glazen capillaire. Trek de injectienaald met behulp van een naald trekker.
   3. Gebruik een getrokken Pastuer pipet om de naald terug te vullen met de verdunde verf.
   4. Plaats de naald in een licht-vrije, bevochtigd kamer tot gebruik.
3. Pre-Injectie: Het opzetten van de microscoop en naald.
   1. Mount injectienaald op injectie apparaat. Onze apparatuur is een Narishige directe aandrijving micromanipulator gemonteerd op het podium van een Nikon TE200 omgekeerde microscoop uitgerust met DIC imaging mogelijkheden.
   2. Sluit de naald met een 1,2 mm ID buis die is aangesloten op de drukregelaar. Ofwel samengeperste lucht of stikstof kan gebruikt worden als een externe druk bron. Stel de regulator tot 20-25 psi.
   3. Plaats 2 druppels van zware minerale olie (petroleum olie) op de injectie pad.
   4. Plaats van de injectie pad op de microscoop en laat de naald in de olie. Controleer vrij er zeker van vloeistof stroomt van de naald wanneer druk wordt uitgeoefend. Toe te passen inspuitdruk en luister of vloeistof stroomt uit de naald. Zo niet, dan moet u voorzichtig te breken aan het einde van de naald. De naald kan worden doorbroken door voorzichtig rijden de punt in een klein stukje van het gebroken dekglaasje geplaatst op de injectie pad. Nadat de naald stroomt, door naar de volgende stap.
4. Injectie.
   1. Ongeveer 1 uur voorafgaand aan het bekijken van embryo's, overdracht jong volwassen wormen in de olie druppel op de injectie pad. Voer deze overdracht met behulp van de microscoop ontleden. Gebruik een platina draad worm te halen bij een puntige tip voor de overdracht van wormen.
   2. Schik 3-10 wormen, zodat ze direct liggen op het pad. Voor injectie, is het het makkelijkst als de wormen zijn opgesteld parallel aan elkaar en iets minder dan een worm lengte van elkaar. Zodra de wormen op de injectie pad is het belangrijk om snel te werken en de injectie proces af te ronden voordat de wormen omkomen van uitdroging.
   3. Plaats het dekglaasje met wormen op de microscoop stadium van de injectie microscoop. Focus in het centrale deel (rachis) van de distale gonade buis. Gebruik dan de micromanipulator om de punt van de naald te verplaatsen in dezelfde focal plane. Verplaats het podium horizontaal, zodat de worm wordt doorboord door de naald. Zodra de punt van de naald zich in de rachis, druk uit te oefenen en laat de gonaden te vullen met de kleurstof mengsel. Injecteer beide gonaden armen van alle wormen op de injectie pad.
   4. Na injectie, gebruik dan een getrokken Pasteur pipet tot ongeveer 0,5 ml van Egg buffer te leveren aan de wormen. Dit zorgt ervoor dat ze sterven van uitdroging en hen in staat stellen te herstellen van de injectie procedure.
   5. Laat de wormen om gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur te herstellen in een licht-vrije, bevochtigd kamer.

3. Agarose pad voor het bekijken van embryo's

1. Bereid gesmolten 2% agarose in Egg Buffer.
2. Met een Pasteur pipet, zet drie druppels gesmolten agarose op een schoon objectglaasje.
3. Plaats schuiven tussen twee andere dia's die een laag van etikettering tape op hen hebben. Deze dienen als afstandhouders die ervoor zullen zorgen dat uw agarose pad is de juiste dikte.
4. Plaats een tweede schone microscoopglaasje loodrecht naar beneden op de agarose daalt. Druk naar beneden totdat bovenste dia rust op tape van gids dia's.
5. Net voordat je klaar bent om embryo's voor observatie mount, verwijdert u de bovenste dia.

1. Als wormen niet zijn geïnjecteerd, volg dan de volgende twee stappen. Anders slaan ze.
   1. Kies een jong volwassen wormen van de plaat, dat was bereid de dag voordien. U moet in staat zijn om embryo's in de jonge volwassenen te zien.
   2. Kies 50-20 wormen op een ongeplaatste NGM plaat. Laat de wormen om rond te kruipen op de ongeplaatste plaat voor een paar minuten, zodat de wormen zal verliezen het grootste deel van de bacteriën die vast zit voor hen.
2. Krijgen jonge embryo's van volwassen wormen
   1. Plaats een 50-20 ul druppel Egg buffer in het midden van een 18 mm ² glazen dekglaasje (een dekglaasje dikte van 1,5 heeft de voorkeur).
   2. Bewegen wormen uit de ongeplaatste plaat of injectie pad in de daling van de Egg Buffer.
   3. Opengesneden wormen met een 26 gauge injectienaald. Opengesneden de worm de buurt van de vulva. Moet je zien embryo's uit morsen van de worm.
3. Monteren op microscoopglaasje
   1. Keer de microscoop dia die werd voorbereid met de agarose pad en zakken op de dekglaasje met embryo's.
   2. Als langere tijd lapse is vereist, gebruik vaseline aan de randen van het dekglaasje zegel uitdroging te voorkomen.

5. Microscopie

1. Het vinden van de juiste embryo's.
   1. Plaats slide op microscoop podium. Scan met 10x lens om embryo's te zoeken.
   2. Om te weten een vroeg stadium embryo's, zoeken naar embryo's die in het proces van de voltooiing van de moeder meiose. Meiotische embryo's kunnen worden onderscheiden van latere embryo's, omdat zij niet hebben ondergaan verkorten. (Na embryo's meiose voltooid, kunt u zien een grote kloof tussen het celmembraan en de eischaal aan het voorste einde.)
   3. Als je eenmaal hebt geïdentificeerd een juiste geënsceneerde embryo, verhuizen naar een hogere vergroting lens voor het opnemen van de embryogenese.
2. Imaging
   1. In dit voorbeeld zijn we verbeelden embryo's die de mCherry uitdrukken:: H2B en GFP:: Ub gemerkte eiwitten. Wij maken gebruik van de Zeiss LSM700 conventionele laser scanning microscoop.
   2. Beelden worden verzameld met behulp van de 63x 1.4NA lens. De 488 en 555 lasers worden gebruikt met een minimale en maximale laservermogen te krijgen. AZ stack is verzameld elke 10-15 seconden. Afhankelijk van de mate van fotobleken, zijn 30 tot 60 keer punten verzameld. Z stapel foto's zijn samengebracht in een maximale uitval afbeelding voor de laatste time-lapse video.

6. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Bevruchting tot de eerste Mitose in C. elegans.

Figuur 2. Micro-injectie procedure.

Aanvullende Video 1 Time-lapse video van GFP:.. Ubiquitine plus Lysotracker Blue in een meiose embryo Klik hier om de video te bekijken.

Discussion

Na fusie met het sperma, de zygote ondergaat een reeks van dynamische gebeurtenissen. Deze gebeurtenissen transformeren de eicel van een relatief statische cel in de zich snel ontwikkelende embryo. In veel organismen, cytoplasmatische herschikkingen zijn van cruciaal belang voor het vaststellen van embryonale polariteit en eieren activering. De C. elegans embryo biedt een uitstekende gelegenheid voor het observeren van deze vroege gebeurtenissen van ei activering en embryogenese. Het embryo is transparant en de vroege ontwikkeling gebeurtenissen relatief snel na de bevruchting. C. elegans onderzoekers hebben gegenereerd veel nuttige transgene stammen die fluorescent gelabelde eiwitten die betrokken zijn uitdrukken in de vroege ontwikkeling. Met behulp van deze stammen, samen met RNAi of mutanten levert een krachtig systeem voor het ontleden van de moleculaire pathways dat de ontwikkeling van een meercellig organisme (5, 6, 7, 8) ten grondslag liggen. Deze video artikel presenteert een praktische benadering van het gebruik van deze instrumenten en technieken om gebeurtenissen vast te leggen gedurende de vroege embryogenese in C. elegans.

De volwassen C. elegans eicel wordt gearresteerd in profase van de meiose I en wordt bevrucht in de spermatheca van de volwassen hermafrodiet. Na de bevruchting de eicel opbrengst door de rest van meiose I en II. Deze stadia kan worden waargenomen met behulp van fluorescent gelabelde histon H2B (5). Tijdens de afronding van de moeder meiose, het sperma DNA blijft gecondenseerd (zie figuur 1). Na de voltooiing van meiose, de moederlijke en vaderlijke DNA wordt decondensed en de twee pronuclei formulier. De maternale pronucleus migreert naar de vaderlijke pronucleus en ze samen te voegen in het midden van het embryo. Mitose ontstaat snel na pronuclear vergadering. Al deze gebeurtenissen zich voordoen in minder dan een uur. Zo kan time-lapse microscopie van deze reeks van gebeurtenissen gemakkelijk worden bereikt. Het uitvoeren van deze techniek vereist bepaalde faciliteit in nematode kweken zowel als gewone microscopie vaardigheden in aanvulling op de toegang tot een confocale microscoop.

Het voorbeeld hier gepresenteerde maakt gebruik van een transgene C. elegans stam dat twee fluorescerende eiwitten, GFP uitdrukt:: ubiquitine-en mCherry:: H2B. Een confocale laser scanning microscoop wordt gebruikt om de dynamische lokalisatie van deze twee eiwitten te nemen. Daarnaast tonen we aan dat de injectie van fluorescent gelabelde Lysotracker kan worden gebruikt om het lot van lysosomen in het embryo na de bevruchting te volgen. Injectie van een label tracker kan ook worden uitgevoerd voor visualisatie van de mitochondriën of lokale calcium-concentraties (9). In theorie zou de injectie-protocol worden gebruikt om elke vorm van fluorescent gelabelde moleculen in de embryo. Dit kan het label kleine moleculen, eiwitten, vetten, enz. In sommige gevallen zijn, kan het niet nodig om daadwerkelijk te injecteren bestempeld trackers als de wormen zal gemakkelijk opname sommige kleurstoffen zoals mitotracker (10). Toch hebben we geprobeerd zowel de weken en injectie van lysotracker en hebben gevonden veel betere resultaten met injectie voor visualisatie in embryo's.

Technische overwegingen:

De technische uitdagingen die met deze procedure zijn de micro-injectie techniek en de moeilijkheid beeldvorming zeer vroege embryo's. Ten aanzien van micro-injecties, de dikte van de agarose injectie pad is van cruciaal belang voor een succesvolle injecties. Als het pad te dik is, zullen de wormen dessicate en sterven snel. Als het pad is te dun is, zullen de wormen niet aan de pad tijdens de injectie proces.

De vroege embryo's kunnen worden gevoelig zijn voor omgevingsfactoren, zoals temperatuur en buffer omstandigheden. Wild-type embryo's starten decondensation van het sperma DNA en pronuclear migratie binnen een minuut of zo van de voltooiing van meiose II (4). Binnen 20 minuten moet de eerste cytokinese te beginnen. Als embryo's worden blootgesteld aan zeer hoge intensiteit laser of oververhit of geplet tijdens de montage, kan dit proces worden verstoord. Dergelijke embryo's zullen arresteren ontwikkeling. Als dit gebeurt, moet het experiment worden herhaald met verminderd vermogen laser of een dikkere agarose pad.

C. elegans embryo's doen hun eierschaal niet scheiden tot kort na de bevruchting. Gedurende de korte tijd tussen de bevruchting en de afscheiding van de eierschaal, de embryo's niet levensvatbaar zijn buiten de moeder (11). Sommige laboratoria kunnen voorkomen deze uitdaging door de beeldvorming embryo's in utero (5, 12). In utero beeldvorming biedt bepaalde voordelen zoals de mogelijkheid om gebeurtenissen die zich voordoen tijdens of vlak na de bevruchting vast te leggen. Echter, deze techniek vereist het gebruik van een microscopie-systeem dat zorgt voor diep weefsel beeldvorming. Systemen zoals twee-foton of multi-foton zijn bijzonder geschikt voor deze (13, 14). Bij het gebruik van een conventionele laser-scanning of een draaiende schijf confocale microscoop, de beste beelden worden verkregen uit embryo's die hageweest uitgesneden van de volwassen worm zoals hier beschreven.

Imaging System overwegingen:

Het type van de confocale gebruikte beeldvormende systeem is afhankelijk van de behoeften van de gebruikers. In het algemeen worden laser scanning systemen aanbevolen als men wenst om beelden te verwerven met de hoogst mogelijke resolutie. Aan de andere kant, zijn draaiende schijf stelsels die beter voor de beeldvorming zeer dynamische processen als afbeelding overname is relatief snel en fotobleking / fototoxiciteit wordt verminderd.

De specifieke imaging parameters is afhankelijk van het experimentele ontwerp en de confocale werkzaam imaging systeem. In multidimensionale beeldvorming, dient men te overwegen het aantal kanalen, focale vliegtuigen, en de tijd-punten worden verzameld. Als gevolg van de beperkende effecten van fotobleken en fototoxiciteit, kan een eindig aantal beelden worden verworven in een bepaald experiment. Dus, als u ervoor kiest om het aantal kanalen te verwerven te verhogen, moet u waarschijnlijk het aantal van focale vliegtuigen en / of tijd punten en vice versa te verminderen. Het totaal aantal beelden dat kan worden verkregen zal worden beïnvloed door de intensiteit van het fluorofoor in beeld wordt gebracht, alsook de gevoeligheid van de confocale microscoop wordt gebruikt. Meer intense fluoroforen en meer gevoelige instrumenten vereisen kortere belichtingstijden en dus produceren minder fotobleken en fototoxiciteit.

Een groot aantal of imaging systemen zijn beschikbaar. We geven informatie over de systemen die zijn gebruikt in onze eigen laboratoria. Voor de beeldvorming worm embryo's door draaiende schijf confocale microscopie, gebruiken wij een Nikon TE2000U omgekeerde microscoop uitgerust met een 60X/1.4 NA Plan Apo doelstelling. De microscoop is aangesloten op een Yokogawa CSU10 draaiende schijf-eenheid, een Hamamatsu C9100-13 EM CCD-camera, en een Spectral Applied Research LMM5 laser-merge module met vier solid state lasers met een vermogen van 405, 491, 561 en 655 nm. Met behulp van dit systeem kunnen we vangen een of twee kanalen, zes tot twaalf focale vliegtuigen, 25 tot 50 tijdstippen (na 30 tot 60 seconden). Een typische blootstelling tijd is 100 tot 200 milliseconden.

Voor beeldvorming embryo's met laser scanning confocale microscopie, gebruiken we een Zeiss LSM700 uitgerust met 2 kanalen en vier solid state lasers (405, 488, 555 en 635 nm). Dit systeem is gekoppeld aan een Zeiss Axio Observer omgekeerde microscoop met een Plan-Apo 63X/1.4NA doel gebruikt worden voor embryo beeldvorming. Het systeem maakt gebruik van de Zeiss ZEN software voor het imago van acquisitie, die ook voorziet in beperkte beeldverwerking en analyse. Wanneer beeldvorming met twee fluorochromen, typisch we 1-5 focale vlakken (~ 0.5 micrometer van elkaar) te verzamelen en het verzamelen van een Z-stack om de 15 seconden. Collecties worden voortgezet tot een significante fotobleken heeft plaatsgevonden. Voor het genereren van de laatste time-lapse video, zijn Z stapel foto's worden geconsolideerd volgens de maximale projectie tool in de ZEN software. Video's worden geëxporteerd vanuit de software als avi-bestanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg Buffer			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Injection Capillary Pipet	Harvard Apparatus	GC120F-10
Needle Puller	Kopf Instruments	Model 700C
Microinjector Apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator