الصداع النصفي والصداع النصفي تحولها إلى أعباء الرعاية الصحية المزمنة هي في حاجة هائلة من الخيارات تحسين العلاج. نسعى الى تحديد كيفية يشير المناعي العصبي ينظم التعرض للالصداع النصفي ، على غرار<em> في المختبر</em> باستخدام الاكتئاب تنتشر في الثقافات شريحة الحصين ، كوسيلة لتطوير الأهداف العلاجية الرواية.
الصداع النصفي والصداع النصفي تحولها إلى أعباء الرعاية الصحية المزمنة هي في حاجة إلى تحسين خيارات العلاج. نسعى الى تحديد كيفية يشير المناعي العصبي ينظم التعرض للالصداع النصفي ، وعلى غرار في المختبر باستخدام الاكتئاب ينتشر (SD) ، كوسيلة لوضع أهداف علاجية جديدة لالصداع النصفي العرضية والمزمنة. SD هو السبب المحتمل لهالة الصداع النصفي وآلام الصداع النصفي. وهو فقدان وظيفة الخلايا العصبية الانتيابي الناجمة عن زيادة نشاط الخلايا العصبية في البداية ، والذي ينتشر ببطء داخل مناطق الدماغ عرضة للإصابة. عادية وظيفة الدماغ حساس بشكل رائع ل، وتعتمد ، تتزامن على مستوى منخفض يدل المناعي. وهكذا ، يشير المناعي العصبي يؤثر على النشاط الكهربائي من المرجح SD ، وبالتالي الصداع النصفي. دراسات الإحساس بالألم من SD في الحيوانات كلها محفوفة بالصعوبات ، بل هي مناسبة تماما لفحص الحيوانات كلها جوانب بيولوجيا الأنظمة من الصداع النصفي منذ SD ينشط المسارات nociceptive مثلث التوائم. ومع ذلك ، لا يمكن أن الدراسات الحيوانية كلها وحده يمكن استخدامها لفك الآليات الخلوية والدوائر العصبية من SD. بدلا من ذلك ، في التحضيرات المختبر حيث يمكن التحكم في الظروف البيئية اللازمة. هنا ، من المهم أن ندرك حدود شرائح الحادة ومزايا واضحة للثقافات شريحة الحصين. يمكن شرائح الدماغ الحادة لم تكشف عن التغييرات الطفيفة في الإشارة المناعي منذ إعداد شرائح المشغلات وحده : الموالية للالتهابات التغييرات التي الماضي يوما ، وسلوك صرعي بسبب المستويات العالية للتوتر الأوكسجين اللازم لتنشيط الشرائح ، لا رجعة فيه واصابة الخلية في مراكز شريحة نقص الأكسجين.
في المقابل ، يشير ندرس المناعي في شريحة ناضجة الثقافات الحصين منذ الثقافات توازي في الجسم الحي مع نظيره الدالة trisynaptic ناضجة ، تظهر الخلايا النجمية هادئة ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، ومستويات خلوى ؛ ويتسبب بسهولة في إعداد SD unanesthetized. وعلاوة على ذلك ، فإن شرائح طويلة الأمد ويمكن أن يتسبب SD في أيام متتالية دون وقوع إصابات ، مما يجعل هذا المستحضر الوسيلة الوحيدة القادرة على أحدث نماذج من العواقب neuroimmune من SD المزمن ، والصداع النصفي المزمن وبالتالي ربما. نحن نستخدم تقنيات الكهربية والتصوير غير الغازية لقياس الخلية العصبية ووظائف الدوائر تتزامن مع SD. تقاس العصبية التعبير الجيني المناعي مع المتغيرات الفرز qPCR ، صفائف qPCR ، والأهم ، واستخدام preamplification [كدنا] للكشف عن مستوى الأهداف المنخفضة جدا مثل انترفيرون غاما به كله ، والإقليمية ، أو محددة تعزيز خلية (عن طريق التشريح المجهري ليزر) أخذ العينات. ويتم تقييم المزيد من تتالي إشارات خلوى مع الأهداف ذات الصلة مع بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين المضاعفة التعبير الجيني والتغيرات بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين أكد عبر خلية محددة immunostaining. تستخدم استراتيجيات الدوائية وسيرنا وتعدل لتقليد إشارات المناعي SD.
SD هو اضطراب في الدماغ الانتيابي الخصائص هي التي تحفظ للغاية في جميع مناطق الدماغ فحص الأنواع وحتى الآن. تدرس عادة SD في القشرة المخية الحديثة. ومع ذلك ، فإن تعقيدات الدوائر العصبية لهذا الهيكل (مقارنة الحصين) ، فضلا عن عدم القدرة على الحفاظ على القشرة المخية الحديثة على قيد الحياة في المختبر مع وظائف جهاز المناعة هادئة لفترات طويلة ، وجعلها أقل فائدة باعتبارها استعدادا المختبر لتحديد الآثار طويلة الأمد SD من الحساسية. في المقابل ، ليس فقط الحصين بنية الدماغ التي هي الأكثر حساسية للSD ، وهو أيضا بنية archicortical مع هيكل الدوائر العصبية أكثر بساطة وظيفة ، والتي هي مناسبة تماما لتحديد الوسائل التي neuroimmune النشاط العصبي يمكن أن تعدل SD الحساسية .
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS – 19108) ، والمعهد الوطني لصحة الطفل والأمراض (PO1 – HD09402) ، ومؤسسة البحوث ومؤسسة الصداع النصفي الأبيض. السيدة مارسيا P. Kraig ساعد في إعداد وصيانة أنظمة الثقافة.
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number |
---|---|---|
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010 |
Earle’s Balanced Salt Solution | Sigma | E2888 |
Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 |
Glutamax | Invitrogen | 35050 |
Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 |
Fungizone | Invitrogen | 15295 |
D-glucose | Sigma | G8769 |
Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium
[header] | |||
---|---|---|---|
Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
Gem-21 Neuroplex | Gemini Bioproducts | 400-160-010 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 | |
D-glucose | Sigma | G8769 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
Fungizone | Invitrogen | 15295 | |
Sodium chloride | Sigma | S6546 | |
Magnesium chloride | Sigma | M1028 | |
Calcium chloride | Sigma | 21115 |
Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium
[header] | |||
---|---|---|---|
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) | Thermo Fisher | PICM0-3050 | |
6-well Falcon culture dishes | Thermo Fisher | 08-772-1B | |
Sytox Green | Invitrogen | S7020 |
Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes
[header] | |||
---|---|---|---|
Glass capillary tubes | A-M Systems, Inc. | 2mm x 1.16mm, 4 inches | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Agar | Fisher Scientific | A360 | |
EDTA | Sigma | 5134 | |
Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
1.5 mL centrifuge tube rack | Fisher Scientific | ||
Silver wire | Medwire | AG15X | |
Hemostat | Fine Scientific Tools | 13018-14 | |
Emery board | Walgreens | ||
Scintillation vial | Fisher Scientific | ||
Flexible adhesive sealant | Amazing Goop | ||
Bleach | Clorox |
Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes
[header] | |||
---|---|---|---|
Borosilicate filament | Sutter Instruments | BF150-86-10 | 1.5 x 0.86 mm |
Microelectrode puller | Narashige | PE-2 | |
Eye piece optical micrometer | Zeiss | ||
Stage optical micrometer | Zeiss | ||
Compound Microscope | Zeiss | ||
Microscope slides | Surgipath | 00210 | |
1-Dimensional microelectrode manipulator | Narashige | MO-10 | |
3-dimensional microelectrode manipulator | Narashige | MM-3 | |
Adhesive putty | Scotch | ||
100 mm Nalgene containers | Fisher Scientific |
Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes
[header] | |||
---|---|---|---|
Teflon-coated platinum iridium wire | A-M Systems | 7780 | 125 μm bare, 200 μm coated |
Forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
Hemostat | Fine Scientific Tools | 13018-14 | |
30 gauge wire | Tensolite | ||
Soldering iron | Cooper Tools | UTC 100 | |
Solder | Bernzomatic | Resin core, lead free, silver bearing | |
Concentrated HCl | Fisher Scientific | A144-212 | |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
Water-resistant epoxy | JB Weld | ||
Banana jacks | Newark Electronics |
Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes
[header] | |||
---|---|---|---|
Falcon 35 mm culture dish | Becton Dickinson Labware | ||
Glass filament tubes | Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | 1.0 mm, 12 mm long |
Cotton squares | Walgreens | ||
Forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
Poly vinyl chloride film | Fisher Scientific | 01810 | 18 inches x 1000 feet |
#9 single edge razor blade | Smith |
Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes
[header] | |||
---|---|---|---|
Recording chamber | Medical Systems Corp. | PDMI-2 | Recording chamber |
Bipolar temperature control | Medical Systems Corp. | TC-202 | |
Combination pH electrode | Microelectrodes Inc. | MI-413 | |
pH meter | Beckman | 250 | Battery operated |
Mini Type-T thermocouples | Physiotemp | IT series | |
DigiSense thermometer | Cole-Palmer | 8528-10 | |
Inline heater | Warner Instruments | SH278 | |
Gibraltor table | Burleigh | ||
Inverted microscope | Leica | DMIRE2 | |
Anti-vibration Table | Technical Manufacturer’s Corp | 63-541 | |
Cautery tool | Gemini | Battery operated | |
Microelectrode micromanipulators | Narashige | WR60 | Left and right |
Stabilized power supply | MGE UPS systems | Ellipse 1200 | +/- 5 volts (120 total) |
Axoprobe amplifier system | Axon instruments | 1-A | |
Active filter | Frequency Devices | Model 900 | |
Axoscope Digidata | Axoscope | 1322-A | |
Axoscope software | Axoscope | v. 9 | |
Computer systems | Dell | Precision T5400 | |
Origin8 | OriginLab Corp | v. 8.1 | |
Stimulator isolation unit | Bak Electronics, Inc. | BSI-II | |
1/2 inch position magnets | Dexter | PMO90-3 | |
3 inch position magnets | Dexter | PMC-800T | |
Multiple X-Blocks | Narishige | X-12 | For positioning ball joints |
Valves | Hamilton | HVD-3 | For medium delivery |
Syringe pump | Razel | A99 | |
Digital oscilloscope | Agilant technologies | ||
Digital camera system | Quant EM | 512-SC | |
MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
Microscope objective focus with Pi foc | Physik Instrumente | E-662.LR | |
Smart shutter | Lambda SC | ||
Dual wavelength fluorescent microscopy | Applied Scientific Instruments | Polychrome II | |
Peristaltic pumps | Masterflex | 77120-62 | |
Aspirator | Harvard Apparatus | PDMI component |
Table 8. Electrophysiological Setup
[header] | |||
---|---|---|---|
1 M Magnesium Chloride | Sigma | 057K8620 | |
1 M Manganese Chloride | Sigma | 018K6107 | |
1 M Calcium Chloride | Sigma | GA10984 | |
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 | Invitrogen | I21413 | |
Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
Polyvinyl chloride film | Fisher Scientific | 01810 | |
MetaMorph | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
Inverted microscope | Leica | DMIRE2 | |
Camera | QuantEM | 512SC | |
UV light | Kubler | CODIX | |
Bipolar Temperature Controller | Medical Systems Corp | TC-202 | |
Smart shutter | Lambda SC | ||
Sytox Green | Invitrogen | S7020 | |
Falcon 35 mm culture dishes | Becton Dickinson Labware | ||
Glass filament tubes | Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | 1.0 mm, 12 mm long |
Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
Recording chamber | Medical Systems Corp. | PDMI-2 | Recording chamber |
Bipolar temperature control | Medical Systems Corp. | TC-202 | |
Combination pH electrode | Microelectrodes Inc. | MI-413 | |
Gibraltor table | Burleigh | ||
Anti-vibration Table | Technical Manufacturer’s Corp | 63-541 |
Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
[header] | |||
---|---|---|---|
RNAlater | Ambion | AM7021 | |
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Diamond knife | Fine science tools | 10100-00 | |
Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5451C | |
Vortex-genie | VWR | G-560 |
Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest
[header] | |||
---|---|---|---|
Chloroform | Sigma | C-2432 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5451C | in cold room |
Ethanol, 200 proof for molecular biology | Sigma | E7023 | |
RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 |
Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction
[header] | |||
---|---|---|---|
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher | ND-2000 | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma | M-1254 | |
ssRNA ladder | NEB | N032S | |
Sodium acetate | Sigma | S-9513 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethidium Bromide solution | Bio-Rad | 161-0433 | |
OWL easycast horizontal mini-gel systems | Thermo Fisher | B1 | |
Electrophoresis power source | Bio-Rad | PowerPac HC | |
Ultrapure Agarose | GibcoBRL | 15510-019 | |
Microwave | Samsung | SJ0390W | |
RNase Away | Molecular Bioproducts | 7000 |
Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification
[header] | |||
---|---|---|---|
iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 | |
iCycler iQ PCR plates, 96 well | Bio-Rad | 2239441 | |
Flat cap strips – optically clear. 8-cap strip | Bio-Rad | TCS0803 | |
iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 170-8880 | |
Ultrapure Agarose | GibcoBRL | 15510-019 | |
10x TAE buffer | GibcoBRL | 15558-026 | |
Microwave | Samsung | SJ0390W | |
RNase Away | Molecular Bioproducts | 7000 | |
Ethidium Bromide solution | Bio-Rad | 161-0433 | |
OWL easycast horizontal mini-gel systems | Thermo Fisher | B1 | |
Electrophoresis power source | Bio-Rad | PowerPac HC | |
Name | sequence | ||
TNF-α F | 5′ – ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3′ | ||
TNF-α R | 5′ – CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3′ | ||
Rpl13a F | 5′ – TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3′ | ||
Rpl13a R | 5′ – CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3′ |
Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening
[header] | |||
---|---|---|---|
RT2 Profiler PCR array | SABiosciences | PARN-021 | |
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit | SABiosciences | C-06 | |
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix | SABiosciences | PBR-3021 | |
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix | SABiosciences | PA-011 | |
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ | SABiosciences | PPR45050C | |
Multichannel pipettor | Corning | ||
25 mL Bio-pure reservoir with divider | Diversified biotech | REBP-2000 | |
iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 |
Table 14. qPCR array plates and low level signaling
[header] | |||
---|---|---|---|
Centrifuge | Fisher Scientific | Micro 7 | |
Cell lysis kit | Bio-Rad | 171-304011 | |
BSA protein stock | Bio-Rad | 500-0007 | |
BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Sealing tape | Bio-Rad | 2239444 | |
96-well plate reader | Perkin Elmer | 1420-multilabel counter | |
Phospho 6-plex Assay Lysates | Bio-Rad | X7000000502 | |
Phospho 6-plex coupled beads | Bio-Rad | X700000050 |
Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
[header] | |||
---|---|---|---|
Accell 5x siRNA Buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | |
Accell siRNA Delivery Medium | Thermo Scientific | B-005000-100 | |
Accell Cyclophilin Pool-Rat | Thermo Scientific | D-001920-30-05 |
Table 16. siRNA
[header] | |||
---|---|---|---|
16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
Lysine | Sigma | L-6001 | |
Sodium phosphate | Fisher Scientific | S374-1 | |
Sodium periodate | Sigma | S-1878 | |
Sodium azide | Sigma | S-2002 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Tissue-Tek | Ted Pella Inc. | 27050 | |
Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
Tissue slides | Surgipath | 00210 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Hydrogen peroxide (30%) | Sigma | H1009 | |
SFX signal enhancer | Invitrogen | A31631 | |
Goat serum | Colorado Serum Company | CS 0920 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
Anti-NFκβ antibody | Santa Cruz | SC-109 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
Yo-yo nuclear counterstain | Invitrogen | Y-3601 | |
ProLong antifade | Invitrogen | P7481 |
Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry
[header] | |||
---|---|---|---|
Anti-cyclophilin B | R&D Systems | MAB5410 | |
3,3-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
Water bath | Pharmacia Biotech | 56-1165-33 | Gebrüder HAAKE GmbH |
Ammonium hydroxide | J.T.Baker | 9721-03 | |
Silver nitrate | Sigma | S-0139 | |
Sodium thiosulfate (pentahydrate) | J.T.Baker | 3949-01 | &nsp; |
0.2% gold chloride | Sigma | G-4022 | |
Oxalic acid | Sigma | O-0376 | |
CoolSnap fx CCD camera | Photmetrics | ||
MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
Inverted microscope | Leica | DM IRBE | |
Neutral density filters | Chroma | 0.5-3.0 optical density unit range |
Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry