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Neuroscience

Modellistica neurale segnalazione immunitario di emicrania episodica e cronica utilizzo Depressione Diffusione In Vitro Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
* These authors contributed equally

Summary

Emicrania e la sua trasformazione da emicrania cronica sono oneri sanitari immenso bisogno di migliori possibilità di cura. Cerchiamo di definire le modalità di segnalazione neuronali immunitario modula la suscettibilità di emicrania, modellato

Abstract

Emicrania e la sua trasformazione da emicrania cronica sono oneri sanitari che hanno bisogno di migliori possibilità di cura. Cerchiamo di definire le modalità di segnalazione neuronali immunitario modula la suscettibilità di emicrania, modello in vitro utilizzando depressione diffusione (SD), come mezzo per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per l'emicrania episodica e cronica. SD è la probabile causa di aura emicrania e il dolore dell'emicrania. Si tratta di una perdita parossistica della funzione neuronale innescata inizialmente un aumento dell'attività neuronale, che si propaga lentamente all'interno di regioni cerebrali sensibili. Normali funzioni cerebrali è estremamente sensibile a, e si basa su, coincidente segnalazione immunitario di basso livello. Così, neurali segnalazione immunitario colpisce probabile attività elettrica di SD, e quindi l'emicrania. Studi sul dolore percezione di SD in animali interi sono irto di difficoltà, ma animali interi ben si adattano ad esaminare gli aspetti della biologia dei sistemi di emicrania da quando SD attiva trigemino vie nocicettive. Tuttavia, studi su animali tutto da solo non può essere usato per decifrare i meccanismi cellulari e circuiti neurali di SD. Invece, in preparati in vitro dove le condizioni ambientali possono essere controllati sono necessari. Qui, è importante riconoscere i limiti delle fette acuta e vantaggi di culture fetta dell'ippocampo. Sezioni di cervello acuto non può rivelare sottili cambiamenti nella segnalazione immunitaria dopo la preparazione le fette solo trigger: pro-infiammatorie cambiamenti ultimi giorni, il comportamento epilettiforme causa degli alti livelli di tensione di ossigeno necessario per vitalizzare le fette, e danno cellulare irreversibile nei centri fetta anossica.

Al contrario, esamineremo segnalazione immunitario maturo culture fetta ippocampo perché le culture sono molto simili a loro controparte in vivo con mature funzione trisynaptic; spettacolo astrociti quiescente, microglia, e livelli di citochine e SD è facilmente indotta in una preparazione non anestetizzati. Inoltre, le fette sono longevi e SD possono essere indotti in giorni consecutivi, senza pregiudizio, rendendo questa preparazione l'unico mezzo fino ad oggi-in grado di modellare le conseguenze neuroimmune di SD cronica, emicrania e così forse cronica. Utilizziamo tecniche elettrofisiologiche e di imaging non invasivo per misurare delle cellule neuronali e funzioni del circuito in coincidenza con SD. Neurali immunitario variabili espressione genica sono misurati con lo screening qPCR, array qPCR, e, soprattutto, l'uso di pre-amplificazione del DNA per il rilevamento di ultra-basso livello di obiettivi quali l'interferone-gamma con tutto, regionale, o specifici delle cellule avanzata (tramite microscopia laser dissezione) campionamento. Cascata di segnali citochina è ulteriormente valutata con obiettivi fosfoproteina multiplex correlati con l'espressione genica e cambiamenti fosfoproteina confermato tramite specifici delle cellule immunocolorazione. Strategie farmacologiche e siRNA vengono utilizzati per imitare e modulare SD segnalazione immunitario.

Protocol

Vari punti sono da sottolineare per lo studio di successo di immuno-correlati segnalazione SD in fettine di cervello. In primo luogo, gli stimoli di origine deve sincrono depolarizzare un volume sufficiente di materia grigia del cervello di avviare SD. Ciò significa che una configurazione di interfaccia (ad esempio, l'esposizione del liquido solo sotto e lo scambio di gas sopra inserire fetta della cultura) è obbligatorio. 1,2 In secondo luogo, fettine di cervello acuto sostenere SD, ma il trauma da loro preparazione, così come l'uso del 95% di ossigeno aerato Ringer generare pro-infiammatorie cambiamenti e comportamenti epilettiformi rispettivamente, che possono alterare la funzione neuronale circuito e l'omeostasi del sistema immunitario. 3 Terzo, mentre le culture fetta ippocampo superare questi limiti fetta acuta, è importante notare che le culture fetta dovrebbe essere mantenuto per periodi adeguata prima uso (cioè, superiore a 10 giorni in vitro) in modo che gli astrociti e microglia diventare quiescente. 3-5, infine, SD deve essere indotto con tecniche sterili e asettici. Le tecniche descritte di seguito sono stati progettati per soddisfare questo bisogno.

1. Diffondere la depressione nelle culture Slice

  1. Cultura la preparazione e la manutenzione.
    1. Culture fetta sono preparati e mantenuti in cavalli di siero a base di medie o di un mezzo privo di siero (SFM) 6,7 come descritto in precedenza 8, con piccole modifiche al mezzo. Parametri di incubazione sono 36 ° C, 5% CO 2, 95% di umidità dell'aria-equilibrio.
      1. Troviamo che le culture possono essere commutati a SFM dopo 18 giorni in vitro e mantenuto per almeno 35 giorni in vitro mediante l'uso dei nostri SFM definite in precedenza, che include il calcio supplementare e magnesio.
      2. Inoltre, gli antibiotici e un antifungicide vengono aggiunti per evitare la contaminazione infettivi associati a episodi di registrazione multipla.
      3. Questo lungo termine (o di registrazione) la formulazione di medie dimensioni contiene (per 100 ml): media Neurobosal, 97 mL; Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mm), 0,5 ml; gentamicina (10 mg / ml), 10 L; D-glucosio (45%), 680 microlitri, acido ascorbico (0,5 M), 100 l; Fungizone, (250 mg / ml), 400 microlitri; NaCl (5,0 M), 820 microlitri, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 microlitri; CaCl 2 (1,0 M), 160-240 microlitri.
      4. Le culture sono utilizzati per SD 21-35 giorni in vitro.
    2. Vitalità verifica. 3,6,7
      1. Le culture sono sottoposti a screening per la prova della morte dei neuroni piramidali prima dell'uso.
        1. A 18 giorni in vitro, gli inserti sono incubate per 20 minuti in media (in condizioni normali di incubazione) contenente 5 mM Sytox verde, un marker che diventa fluorescente quando si lega al DNA (cioè, penetrando nelle cellule morte).
        2. Gli inserti sono poi trasferiti al loro media precedente ed esaminate al microscopio a fluorescenza (504 eccitazione e 523 di emissione) per la prova di CA3 o piramidali CA1 lesioni strato di neuroni.
          1. Fette con più di 20 cellule o un livello standardizzato di fluorescenza maggiore di 250 UI sono stati esclusi da un ulteriore uso.
  2. Materiali di fabbricazione.
    1. Elettrodi di massa sono realizzati con tubi di vetro (2,0 mm di diametro / ID 1,16 mm) tagliato a 4,5 mm di lunghezza e brevemente lucidate a fuoco ad entrambe le estremità.
      1. Facciamo circa 20 elettrodi in un momento, che può durare per più di un anno.
      2. Portare 100 ml di KCl 1M ad ebollizione e aggiungere, mescolando, 3,5 g di agar e 0,5 g di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato) per produrre una soluzione trasparente di colore giallo.
      3. Utilizzare un breve tratto di tubazione flessibile montato su ogni tubo di vetro per disegnare caldo KCl / agar soluzione nei tubi di vetro, nonché a breve distanza nel settore dei tubi flessibili.
        1. Rilascio di aspirazione e consentire la KCl / agar a sgocciolare lentamente dalla punta aperta di un tubo di vetro, premere e tenere aperta la punta del tubo di vetro contro un pezzo di ghiaccio.
        2. La manovra Quest'ultimo chiederà di agar gel sulla punta dell'elettrodo e non gel dopo sfuggente back up nel tubo di vetro.
      4. Una volta che l'agar ha gelificato in acqua fredda, il tubo flessibile può essere rimosso senza alterare l'agar posizionati nei tubi di vetro.
      5. Mettere 0,5 ml di 1 M KCl in ciascun pozzetto di un rack 1,5 provetta ml. Poi mettete una punta di ogni KCl / agar tubo di vetro riempito di singoli pozzetti.
      6. Successivamente, tenere un 80 cm di lunghezza di 15 gauge d'argento con un hemostat e pulito ognuno dei quattro lati raschiando il filo attraverso una scheda di Emery tenuto al piano di lavoro.
      7. Tagliare il filo in 4 lunghezze di cm e metterli in una fiala di scintillazione pieno di candeggina per 20-30 minuti per inserire un Ag-AgCl mano ferma sulla superficie d'argento pulita.
      8. Piegare ogni filo a metà e inserire le estremità libere in una delle estremità del tubo di vetro riempito wi° KCl / agar, lasciando circa 4-6 mm esposti.
      9. Infine, il cappotto il gambo tubo di vetro contenente il filo d'argento e in piccola parte del filo con Goop, una colla resistente all'acqua e flessibile, per evitare che il KCl / agar si secchi. Ripetere l'operazione per tutti gli elettrodi. Lasciate asciugare la colla durante la notte.
      10. Conservare gli elettrodi a 4 ° C in fiale di scintillazione (5-6 elettrodi / flaconcino) contenente ~ 5 ml 1 M KCl e 25 mg di EDTA, che ritarda notevolmente la crescita batterica.
    2. Elettrodi di registrazione sono costituiti da 1,5 mm di diametro (0,86 mm ID, 10 cm di lunghezza), tubi in vetro borosilicato con filamenti (Video Figura 1).
      1. Tirare microelettrodi a punta fine con tubi di vetro corta tirata da una punta acuminata.
        1. Noi di solito tirare elettrodi ~ 7,5 cm di lunghezza con un cono 1 cm. Questo consente un posizionamento adeguato e punta visualizzazione elettrodo.
        2. Gli elettrodi sono tirato con un PE-2 Narishige estrattore.
        3. Microelettrodo punte sono rotte torna a 2-4 micron sotto la visualizzazione utilizzando un microscopio composto dotato di un micrometro ottico calibrato. Noi usiamo il bordo di una diapositiva standard di istologia di vetro (25 x 75 x 1 mm) collegato a un idraulico monodimensionale micromanipolatore detenuto da un altro 3-dimensionale manipolatore di rompere delicatamente le punte microelettrodo.
          1. In primo luogo, l'elettrodo è montato collegata ad un vetrino da microscopio utilizzando argilla.
          2. Poi la diapositiva è posta sulla porta vetrino da microscopio che viene utilizzato per spostare la punta microelettrodo vicino al bordo del bicchiere scivolato attaccato al manipolatore idraulico.
          3. Infine, la punta di un microelettrodo è leggermente rotto premendolo contro il bordo microscopio ad azionamento idraulico di diapositive.
    3. Elettrodi stimolanti sono intrecciati fili elettrodi bipolari in quanto:
      1. Consentono la registrazione dei potenziali evocati campo, che altrimenti sarebbe oscurata dalla artefatto da stimolo stimolazione monopolare.
      2. Un elettrodo bipolare stimolante può essere delicatamente applicata sulla superficie giro dentato senza danno, a differenza appuntiti elettrodi bipolari.
      3. Infine, applicata corrente è localizzato nella trasversale (nudo) superfici circolari dei fili isolati in Teflon utilizzata per l'elettrodo.
        1. Fabbricazione di elettrodi stimolanti inizia con il taglio circa 20 cm di lunghezza di platino-iridio (125 micron di diametro nudo, 200 micron di diametro rivestito) e filo di teflon. Poi, piegare la lunghezza a metà e legare le estremità in un nodo allentato piazza, lasciando circa 2 cm dal nodo alle estremità del filo.
        2. Fissare il nodo nel mandrino di un trapano elettrico collocato su un tavolo.
        3. Mentre si tiene l'altra estremità del filo con un hemostat, brevemente girare il trapano e spegnimento fino a quando il filo è avvolto (cioè, ogni superficie di taglio sarebbe stessa distanza dalle altre, quando il filo viene tagliato in direzione trasversale, senza svelare ).
        4. Successivamente, le estremità prive di platino-iridio fili intrecciati bisogno di essere collegato a condurre i fili utilizzati per collegare l'elettrodo stimolante ad un isolatore stimolo.
          1. Questo viene fatto tramite saldatura le estremità libera del filo di platino-iridio di ~ 50 cm 30 fili di diametro.
          2. In primo luogo, il nastro di platino-iridio filo ritorto ad un banco ed è caduta una pozza di HCl concentrato oltre un estremità libera del filo intrecciato.
            1. Poi, togliere circa 1 cm di isolamento da ogni filo con un cutter filo.
            2. Posizionare l'estremità spogliato su un cavo adiacente alla fine del filo ritorto e applicare calore da una punta fine saldatore, poi saldare fino a quando i due fili siano ben fissati.
          3. Scivolare una lunghezza piccola di tubo termorestringente sopra il collegamento del cavo a vista e ridurla in forma con il calore.
          4. Ripetere l'operazione per il secondo filo.
          5. Fuoco lucidare la punta di una pipetta Pasteur cm 15 e guida i contorti fili di platino-iridio giù la pipetta fino a circa 6 cm di sporge contorte fuori.
          6. Utilizzare una resina epossidica idrorepellente (ad esempio, JB Weld) a sigillare entrambe le estremità dell'elettrodo.
          7. Infine, collegare connettori a banana fino agli estremi confini cavo per il collegamento dell'isolatore stimolo.
          8. Sotto osservazione stereoscopica, posizionare la punta dell'elettrodo in PBS e cercare bolle elettroliticamente prodotto proviene solo alla fine taglio delle punte dell'elettrodo. Se le bolle vengono dal lato dei fili intrecciati, tagliare l'elettrodo con un taglio trasversale con un nuovo singolo lama di rasoio bordo di ristabilire isolamento intatto agli assi lungo filo.
          9. Quando la risoluzione dei problemi da risolvere gli effetti di stimolo aberrante, prova a fare un elettrodo di punta appena tagliato.
    4. Piatti di registrazione costituiti comepidocchi inserire la cultura in un piatto di 35 millimetri cultura che si trova su due aste di 1,0 mm x 12 vetro distanziate circa 1,0 cm l'uno dall'altro. Fissare bacchette di vetro alla base piatto da riscaldamento i tubi di vetro e poi premendo li nella base con una pinza.
      1. Per le condizioni di registrazione statica, aggiungere 1,5 mL di media al piatto.
      2. Quindi, immergere un pezzo cm ~ 10 mm e lungo 3-4 di cotone sterile in 1,0 ml di terreno. Piegare il cotone a metà lungo l'asse e posizionarlo lungo il pozzo interno sul foglietto con una pinza sterile. Il cotone bagnato aiuta a mantenere l'umidità piatto.
      3. Tre comprimibile 4 lunghezze mm di tubi sono equidistanti attorno l'inserto.
      4. Coprire il piatto forte con film di cloruro di polivinile, che permette lo scambio di gas.
      5. Taglio intorno al suo mid-verticale a parete con una lama di rasoio singolo bordo per rimuovere l'eccesso pellicola di cloruro di polivinile.
  3. Configurazione elettrofisiologici
    1. Una cultura di montaggio fetta di inserimento è posizionato nella camera di registrazione PDMI per le registrazioni elettrofisiologiche.
      1. L'inserto / cultura montaggio piatto nella camera PDMI è coperto da un disco di 2 millimetri di spessore in plastica in dotazione con la camera PDMI, con vari piccoli fori posizionati secondo le necessità per gli elettrodi delle registrazioni, medio afflusso / deflusso tubi, ecc
      2. Noi monitorare periodicamente il pH medio con un elettrodo in miniatura di pH e temperatura combinazione con un tipo di termocoppia miniatura T sonda montata in un contenitore sigillato semi-microelettrodo per garantire la 7.3 pH e 36,0 ° Presupposti C.
      3. La camera di inserimento / è aerata con il 5% di anidride carbonica, il bilanciamento dell'aria e mezzo è tenuta statica o in un flusso (1,2 ml / minuto) di configurazione con il centro inserto tenuto a 35-36 ° C.
      4. Per le condizioni di flusso, di media si riscalda con una stufa in linea, sempre per mantenere il centro della camera di registrazione a 36 ° C.
        1. Un sistema di pompa peristaltica con un rilievo di pressione porta in media alle culture fetta senza pulsazioni dalla pompa. Un aspiratore in dotazione con la camera PDMI è usato per rimuovere dai media l'inserto tramite aspirazione delicata.
      5. Per la stabilità, la camera è montata su uno speciale Burleigh-Gibilterra fase microscopio invertito che contiene un microscopio invertito e si siede su un tavolo privo di vibrazioni.
      6. Piccoli fori aperti tramite l'involucro inserire cloruro di polivinile con un piccolo strumento a batteria cauterizzazione.
      7. Quindi, se una configurazione di flusso deve essere utilizzato, in ingresso e flusso in uscita è iniziata, seguita da posizionamento di un elettrodo di massa. Altrimenti, semplicemente messo l'elettrodo di massa al suo posto.
      8. Elettrodi, tenuto in posizione con micromanipolatori, sono posizionati appena sopra una fetta visualizzato con un microscopio invertito con ingrandimento 5x (Fig. 1).
        1. Inizia con l'elettrodo di registrazione seguito da l'elettrodo stimolante.
        2. Noi usiamo un monitor audio per notare quando il microelettrodo entra in contatto con la fetta. La punta è posizionata a metà lungo CA3 strato piramidale corpo cellulare.
        3. Le registrazioni sono iniziate, e poi l'elettrodo stimolante è toccato delicatamente sulla superficie punto medio del giro dentato.
        4. In entrambi i casi, i movimenti degli elettrodi iniziali sono realizzate con controlli grossolani, e il posizionamento finale solo con l'idraulico, controlli bene con illuminazione a contrasto di fase così che strati di cellule del corpo sono facilmente riconoscibili.
        5. Elettrodi in anticipo ~ incrementi di 25 micron sotto la diretta visualizzazione microscopica.
        6. Una volta elettrodi toccare il tessuto, far avanzare gli elettrodi altri 20-30 micron.
        7. Le registrazioni sono iniziate prima l'elettrodo stimolante sia messo in atto per essere certo che questa non fa scattare SD (cioè, tramite uno stimolo meccanico).
        8. ~ 10 minuti sono autorizzati a passare prima che gli esperimenti sono stati avviati.
  4. Transynaptically indotto SD.
    1. Ottimizzare i potenziali evocati CA3 campo come segue (Fig. 2).
      1. CA3 potenziale campo sono evocati con 100 impulsi ms (0,2 Hz) che iniziano con una corrente che è sufficiente per innescare una reazione (per esempio, ~ 1-5 mA).
      2. Spostare l'elettrodo di registrazione in incrementi lungo l'asse neurone piramidale lungo fino a quando il potenziale campo è massima.
      3. Poi, aumentare la corrente con l'elettrodo di registrazione in questa posizione e nota la risposta massima corrente (per esempio, ~ 10-20 mA).
      4. Infine, l'uso di mezza massima intensità dello stimolo per gli esperimenti (ad esempio, la stimolazione sham controllo periodico).
    2. Determinare la soglia di sinapticamente evocato SD (Fig. 2).
      1. Con gli elettrodi configurato come descritto sopra per i potenziali evocati campo, cambiare il paradigma di stimolazione singolo, raffiche manualmente evocatidi 10 impulsi (10 Hz a 100 ms / impulso), un paradigma precedentemente applicate in studi su animali interi.
      2. Aumentare progressivamente l'intensità di corrente per scoppiare stimolo fino SD viene attivato. Attendere almeno 60-120 secondi tra stimoli.
      3. Segnala soglia SD in coulomb (cioè, il tempo x corrente).
    3. In altri esperimenti che richiedono la misurazione risposte alla induzione di molteplici DS, utilizzare una forza stimolo potrebbe evocare SD (ad esempio, ~ 100-500 nC).
      1. Innescare SD ogni 9 min per un'ora.
      2. Assicurarsi di utilizzare tecniche asettiche durante gli esperimenti.
      3. Dopo l'ultima SD, restituire l'inserto cultura di normali condizioni di incubazione.
        1. Segna il piatto cultura notare la cultura che con esperienza SD.
        2. La nostra abitudine è quella di inserire un segno di singolo a sinistra e due marchi a destra dell'inserto cultura fetta, notando ciascuna delle tre culture come # 1, # 2 e # 3 da sinistra a destra.
        3. Cambia media ogni 3-4 giorni fino alla raccolta cultura.
    4. Per i ricorrenti SD, seguire le procedure sopra descritte.
    5. Noi di solito prova per un cambiamento nella SD soglia di 1, 3, 7 e 14 giorni dopo un'ora iniziale di molteplici DS.
    6. CA3 settore in rapida cambiamenti possibili e potenziali lenti sono registrati tramite i sistemi di elaborazione digitale del segnale separati.

2. Esemplare Imaging Vital in Culture Slice ippocampale

  1. Comportamento dinamico funzionale delle cellule immunitarie residenti (cioè microglia) possono essere monitorati in modo simile nelle culture fetta senza danno cellulare o l'attivazione immunitaria (Fig. 3) 9.
    1. Ad esempio, per l'etichetta microglia per valutare il loro movimento associata a cambiamenti attività sinaptica di SD, abbiamo usato fluoroforo-tagged isolectin-IB 4.
    2. "Lectina PBS" è PBS con cationi aggiuntive (0,1 mm ciascuno CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) dal cationi bivalenti (0,1-1,0 mm) sono necessari per legare lectina di α-D-galattosiltransferasi frazioni sulle membrane delle cellule della microglia.
    3. Ottenere una soluzione di "lectina PBS":
      1. Per 1 L PBS, usando tecniche asettiche e filtrazione sterile, aggiungere:
      2. 100 l di 1M MgCl 2
      3. 100 l di 1M MnCl 2
      4. 100 l di CaCl 2 1M
    4. Mescolare accuratamente per combinare e conservare in frigo a 4 ° C.
      1. Solo 500 ml di "lectina PBS" è necessaria per flaconcino di isolectin, ma dal momento che può essere refrigerati e conservati per mesi alla volta, può essere utile per recuperare volumi maggiori.
    5. Ricostituire AlexaFluor 594-tagged isolectin-IB4 (isolectin) liofilizzato in polvere a 1 mg / ml in "lectina PBS".
      1. Al fine di minimizzare photobleaching, eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile, riducendo al minimo l'esposizione alla luce.
      2. Isolectin può essere aliquotati a 20 l, una volta ricostituito a 1mg/ml e conservati a -20 ° C fino a un anno.
      3. Diluire isolectin a 20 mg / ml nel terreno di coltura e culture fetta incubare a normali condizioni di incubazione 4-10 ore prima di imaging.
    6. Imaging set-up.
      1. Set-up di immagini si compone di: microscopio, otturatore, macchina fotografica, la luce, 2,0 filtro a densità neutra, 36 ° C, a gas: 5% di CO2, l'aria (o il 20% di ossigeno, azoto equilibrio).
      2. Accendere il microscopio, macchina fotografica, la luce UV, controllo della temperatura, i gas e almeno un'ora prima di imaging.
    7. Impostare MetaMorph Imaging Protocol.
      1. Dal "Diario" nel menu a discesa, scegli "Esegui Gazzetta ...".
      2. Questo dovrebbe indurre l'apertura della cartella GIORNALI, da cui si deve selezionare "Motion w-var AFS (rivista precedentemente stabilito che segue le istruzioni riportate di seguito)", cliccare su "Apri".
      3. La "Frequenza Autofocus" finestra pop-up successivo, tenere a numero 1, fare clic su "OK".
      4. Successivamente, l'installazione "sequenziale File Na ..." finestra pop-up, tenere tutto così com'è:
        1. Base Nome: Immagine;
        2. IMMAGINE: 1;
        3. Numero Larghezza: 3;
        4. Salva come: MetaMorph TIFF;
        5. se l'immagine esiste già -> Sovrascrivi automaticamente;
        6. Fare clic su "Seleziona Directory ...", questo farà sì che la" finestra "Sfoglia per cartelle a pop-up. Qui, selezionare la cartella (o creare una nuova cartella) in cui i fotogrammi del film deve essere salvato.
        7. Poi, quando la cartella corretta (es. C: \ Dati cartella \ Nuova) viene visualizzato nella parte inferiore del "File Setup Na sequenziale ..." finestra, fare clic su "OK".
        8. Nella finestra di Acquire:
          1. Selezionare l'impostazione nell'angolo in basso a sinistra per essere DiIMGBIN2;
          2. "Tempo di esposizione": 20 ms; "categorizzazione": 1.
        9. Poi, nella scheda speciale:
          1. "Modalità sensore": FT;
          2. "Digitalizzazionezer ": 10 MHz (guadagno EM);
          3. "Gain": Gain3 (3x);
          4. Selezionare "EM Guadagno: 45"; otturatore della fotocamera: Aperto per esporre; Completa la modalità: CLEAR EXP PRE; Conte chiaro: 2, Trigger Mode & Trigger Mode Live: normale (a tempo).
        10. "Frames Per Media": 3.
        11. Fare clic su "Chiudi".
    8. Dopo aver impostato l'imaging MetaMorph, collocare l'inserto in un piatto di cultura da 35 mm con due aste mm 1 bicchiere sul fondo.
      1. Inserire tre millimetri 2 pezzi di tubo in gomma montato tra le mura del inserimento e il piatto cultura per stabilizzare ulteriormente l'inserto.
      2. Posizionare un pezzo di ~ 10 mm di larghezza di cotone imbevuto di un ulteriore 1 ml di mezzo dentro l'inserto di mantenere un ambiente umidificato. Assicurarsi che sia a filo con le pareti e lontano dal fettine di ippocampo.
      3. Coprire la parte superiore del piatto cultura strettamente con la pellicola di cloruro di polivinile per prevenire la perdita di liquidi.
    9. Assicurarsi che il focus della immagini è lo strato di cellule piramidali CA3. Si noti l'orientamento della porzione di scattare foto in fase di 5x, 10x e 20x.
    10. Nella finestra "Trova Focus" che appare sullo schermo, Range impostato, corrente + / - da "8", e la precisione, in micron (s), da "1" (entrambe le caselle in fondo dovrebbe essere controllato) .
    11. Fare clic su "Trova Focus" per garantire una messa a fuoco dell'immagine.
    12. Nella finestra "Acquisisci Timelapse", selezionare Intervallo di tempo per essere "1 minuto", e durata per essere "6 ore" (questi sono i nostri parametri di acquisizione preferito).
      1. Per catturare i movimenti con precisione microglia, immagini dovrebbero essere meno frequenti di una volta al minuto.
    13. In memorizzazione immagini, selezionare Stack.
    14. L'immagine scatola aggiornamento della finestra deve essere controllato, ma non le altre due caselle sottostanti.
    15. Selezionare "Illum" essere "Lambda".
    16. Fare clic su "OK".
    17. Il film inizierà a correre. Ciò significa che nient'altro può essere effettuata all'interno del programma MetaMorph fino al termine del filmato o finché non si arresta il film inizi facendo clic su Esc, dopo di che il film sarà poi fermarsi al passo successivo all'acquisizione a tempo.
    18. Alla fine del film, verificare la presenza di danno cellulare da uno screening Sytox come detto sopra (A).

3. Estrazione di RNA a basso livello delle citochine segnalazione 11-15

  1. Abbiamo già presentato le istruzioni dettagliate per la rilevazione di basso livello delle citochine segnalazione nelle culture fetta utilizzando qPCR e le tecniche di serie PCR. 6,7
  2. Abbiamo decisamente migliorato la sensibilità dei nostri approcci per la rilevazione di mRNA delle citochine nelle culture fetta e presentare questi miglioramenti qui.
  3. I miglioramenti includono il nostro approccio alla raccolta dei tessuti e l'isolamento di RNA, preselezione dei campioni per il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) cambiare, e preamplfication cDNA, che sono circa 6 volte più sensibile rispetto alle tecniche precedenti e, per esempio, consentono di individuare per la prima volta della cultura fetta interferone-gamma (IFN-λ) di rilevamento 15.
  4. PCR preparazione.
    1. Affettate la cultura della raccolta.
      1. A seguito di esperimenti, inserti cultura fetta sono immersi in 2-3 ml di RNA e successivamente conservato a 4 ° C per un massimo di 3 giorni fino a ulteriori elaborazioni.
      2. Alla raccolta, rimuovere estranei (ossia qualsiasi tessuti adiacenti all'ippocampo corretto) dei tessuti con un coltello di diamante e sollevare le fette in singoli RNase / DNase mL libero 1,5 centrifuga fosfato sterile contenente 0,5 ml di soluzione salina tamponata (PBS) usando una vernice a punta sottile pennello.
      3. Campioni di rotazione (10.000 giri al minuto x 1 minuto) in modo stereotipato così tutte le sezioni aderire alla stessa parte del loro tubi.
      4. Rimuovere PBS surnatante e risospendere campione in 500 microlitri TRIzol.
      5. Conservare i campioni a -80 ° C o di tenere in ghiaccio fino estrazione di RNA.
    2. Estrazione di RNA usingTRIzol con i risultati RNeasy kit Micro in una maggiore resa dell'RNA (Fig. 4) che l'uso del kit da solo.
      1. Scongelare TRIzol-campioni e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      2. Dissociare il prelievo dei campioni di tessuto su e giù con 1 ml punta pippetor e / o vortex fino a quando il tessuto solido non è più visibile.
      3. Aggiungere 100 ul RNasi free (RF), cloroformio e capovolgere tubo di 2-3 volte per mescolare.
      4. Incubare 3 minuti a temperatura ambiente, vortex ogni min.
      5. Centrifugare a 13.000 rpm per 15 min a 4 ° C.
      6. Trasferire il supernatante in un ambiente pulito tubo 1,5 ml microcentrifuga. Fare attenzione a non disturbare l'interfaccia.
      7. Aggiungere un volume equivalente di temperatura ambiente RF 70% etanolo grado di biologia molecolare (~ 300 mL).
      8. Mescolare delicatamente pipettando su e giù un paio di volte.
      9. Continuare con le seguenti operazioni per RNeasy direzioni Kit Micro:
        1. Applicare il campione di una colonna RNeasy micro posto in una collectio 2 mln tubo.
        2. Centrifugare a 10.000 rpm per 15 secondi, scartare flow-through.
        3. Lavare la colonna RNeasy RW1 con 350 microlitri di buffer.
        4. Centrifugare a 10.000 rpm per 15 secondi, scartare flow-through.
        5. Aggiungere 10 uL DNasi 1 soluzione madre a 70 microlitri di buffer RDD, mescolare delicatamente.
        6. Applicare 80 ml di soluzione di DNasi direttamente sulla membrana e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
        7. Lavare la colonna RNeasy RW1 con 350 microlitri di buffer.
        8. Centrifugare a 10.000 rpm per 15 secondi, scartare flow-through e il tubo.
        9. Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna RNeasy.
        10. Centrifugare a 10.000 rpm per 15 secondi, scartare flow-through.
        11. Aggiungere 500 microlitri RF 80% etanolo grado biologia molecolare alla colonna RNeasy.
        12. Centrifugare a 10.000 rpm per 2 minuti, scartare flow-through e il tubo.
        13. Luogo colonna RNeasy in tubi nuovi con i tappi aperti.
        14. Centrifugare alla massima velocità (ad esempio, 14.000 rpm) per 5 min.
        15. Trasferimento colonna RNeasy in una provetta da microcentrifuga RF.
        16. Applicare 14 microlitri di acqua RF direttamente alla membrana.
          1. Centrifugare a 10.000 rpm per 1 minuto per eluire.
          2. Conservare i campioni a -80 ° C o continuare a passi successivi.
    3. RNA quantificazione.
      1. Diluire RiboGreen 1:200 in RF 1x Tris-EDTA (TE) buffer.
      2. Preparare tRNA di lievito da utilizzare come standard di RNA.
        1. Magazzino di lavoro viene memorizzato in -20 ° C a 100 mg / ml
        2. Diluire a 1 mg / ml (10 L nel 990 microlitri TE).
        3. Creare standard come segue: Per 100 ng / mL, aggiungere 100 l, per 80 ng / mL, aggiungere 80 microlitri tRNA e 20 l TE, di 60 ng / mL, aggiungere 60 microlitri tRNA e 40 microlitri TE, di 40 ng / mL aggiungere 40 microlitri tRNA e 60 microlitri TE, di 20 ng / mL aggiungere 20 microlitri tRNA e 80 microlitri TE, e per 0 ng / mL aggiungere 100 ul TE.
      3. Preparare i campioni:
        1. Combina 99 microlitri TE + 1 campione microlitri.
        2. Esegui ciascun campione in duplicato.
      4. Utilizzando un pipettatore multicanale, aggiungere 100 ml di RiboGreen diluito per bene.
      5. Pipetta su e giù per mescolare.
      6. Misurare la fluorescenza su un lettore di piastre.
        1. Fluoresceina (485 nm/535 nm, 0,1 sec) del programma.
        2. Esportare i risultati in un foglio Excel.
    4. Determinare la concentrazione di RNA.
      1. Grafico assorbimento in funzione della concentrazione di RNA e creare un best-fit linea di regressione lineare in Excel.
      2. Determinare le concentrazioni di RNA dal campione l'equazione di regressione associato alla linea di tendenza.
    5. Determinare la qualità dell'RNA.
      1. L'integrità dell'RNA ribosomiale banda viene misurata tramite gel (Fig. 4).
        1. Anche se non è pratico per eseguire una frazione di ogni campione di RNA ottenuto (dal = 1 mg di RNA è richiesto e il nostro rendimento sono piccoli), è una buona idea eseguire periodicamente un gel denaturante di agarosio su un campione esemplare come prova che il metodo , se fatto correttamente, i rendimenti di alta qualità RNA (cioè, senza degrado).
        2. Preparare un 1% gel (per un volume di 100 mL).
          1. Pulire il serbatoio elettroforesi, casting vassoio e gel pettini accuratamente con RNasi AWAY.
          2. Pesare 1 g di agarosio ultrapura in un pallone.
          3. Aggiungere 83 ml di acqua RNasi libero e 10 ml di MOPS 10x [3 - (N-Morpholino) propanesulfonic acido] buffer e forno a microonde fino agarosio è sciolto e la soluzione è chiara (~ 3 min).
            1. Per rendere 10x tampone MOPS
              1. Combina 83,7 MOPS g, 13,6 g di acetato di sodio, e 3,7 g di EDTA.
              2. Aggiungere 800 ml di acqua RNasi libero, mescolare per sciogliere.
              3. Regolare il pH a 7,0 e riempire a 1 L.
              4. Filtro o sterilizzare in autoclave.
              5. Conservare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
          4. Lasciare raffreddare gel a 55 ° C e aggiungere 7 ml di formaldeide al 37% (questo passo dovrebbe essere fatto in una cappa).
          5. Versare il gel nel cast vassoio e gel permettono di solidificare nel cappuccio.
        3. La preparazione dei campioni di RNA.
          1. RNA tampone del campione (500 microlitri, rendono fresca).
            1. Combinare 50 MOPS microlitri 10x, 250 microlitri formammide, 90 microlitri di formaldeide al 37%, 108 microlitri RF H ​​2 O e 2 microlitri bromuro di etidio (soluzione madre 10 mg / mL).
          2. Per mcg 1-10 di RNA, aggiungere doppio del suo volume con tampone del campione, per un triplice diluizione.
          3. Denaturare a 95 ° C per 5 minuti, e poi freddo in ghiaccio per 5 min.
          4. Spin briefly e caricare l'intero campione nei pozzetti accanto ad una scala di RNA (aggiungere colorante carico se lo si desidera).
        4. Elettroforesi
          1. Riempire camera con 1 tampone MOPS.
          2. Elettroforesi a 50-75 volt fino marcatori sono emigrati circa 2/3rd la lunghezza del gel.
        5. Visualizza il gel su un transilluminatore UV.
          1. Verificare che non vi sono nitide e 18S 28S dell'RNA ribosomiale (rRNA) bande, e che la band 28S è due volte più intenso come la band 18S (Fig. 4).
          2. RNA degradato avrà un aspetto macchiato, bande fuzzy, o che non presentano un rapporto di 2:1.
    6. Di solito si usa per valutare la densità ottica di qualità totale RNA.
      1. Anche se non così sensibili, spettrofotometria UV attraverso un NanoDrop è un mezzo rapido ed economicamente efficiente di controllo di qualità RNA.
      2. Cercare densità ottica (OD) 260/280 rapporto di 1,5-2,0.
      3. Tenete a mente che la soluzione in cui è risospeso RNA (tampone TE contro acqua) influenzerà il rapporto OD.
  5. PCR attività.
    1. Pre-PCR di setup
      1. Progettazione primer specifici
        1. Utilizzando Primerblast NCBI è http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. Inserire il gene bersaglio numero di adesione Refseq.
          2. Specificare un prodotto PCR dimensioni da 70 a 200 bp.
          3. Specificare una Tm di 55-72 °, con meno di 5 ° tra differenza primer avanti e indietro.
          4. Selezionare "Primer devono durare un esone-esone giunzione" per ridurre sfondo genomico.
          5. Controllo Attiva specificità per il database Rat Refseq RNA primer per assicurare che non riconoscono ulteriori obiettivi.
          6. Scegliere una coppia di primer dai risultati che si adatta ai seguenti criteri:
            1. 18-30 basi lungo.
            2. Meno di 2000 basi a parte sul modello.
            3. 40-60% citosina-guanina contenuti per garantire legame stabile di primer per modello.
      2. La scelta di un gene di riferimento.
        1. Non tutti i geni di riferimento sarà adatto per il vostro sperimentale istaurato. Ogni volta che si utilizza un nuovo paradigma, la stabilità del riferimento deve essere verificata. Per coerenza, abbiamo scelto di utilizzare uno dei quattro geni di riferimento forniti sulla matrice 2 Profiler RT PCR.
        2. Un gene buon riferimento deve soddisfare i seguenti criteri:
          1. Il suo livello di espressione non è alterata dal paradigma sperimentale.
          2. Si esprime a livelli simili a quella del gene bersaglio.
        3. Per selezionare un riferimento adeguato:
          1. Revisione della letteratura per identificare i probabili candidati per un gene di riferimento stabile nel vostro sistema. Per esempio, abbiamo testato Rpl13a perché è stato dimostrato stabile negli studi di ischemia. 11,12
          2. Primer design come discusso in precedenza (o trovare primer già convalidati per i geni di riferimento comune in un database come RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. Ottimizzare primer accanto primer gene bersaglio (vedi sotto).
          4. Determinare quale candidato di riferimento è più stabile utilizzando un software come Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) che calcola un valore di stabilità per ogni gene in base alla varianza infragruppo e seleziona il gene (s) con la minima espressione variazione sugli esemplari. Per esempio, Rpl13a è un gene di riferimento ottimale per SD (Fig. 4).
      3. Ottimizzare primer.
        1. Per ottenere risultati costanti e affidabili da qPCR, primer devono soddisfare determinati criteri di riproducibilità, sensibilità e specificità.
          1. E 'meglio verificare questi parametri per ogni coppia di primer nuovo.
          2. Riproducibilità è testato per eseguendo tecnico replica.
          3. La sensibilità può essere valutata prestazioni con una curva standard di una successione di 4 diluizioni.
          4. La specificità è determinata confermando un unico prodotto dalle analisi delle curve si fondono e elettroforesi su gel (Fig. 5).
        2. Eseguire un piatto qPCR per testare la qualità della vostra primer, e la concentrazione di primer da utilizzare.
          1. Utilizzando cDNA sintetizzato da tutto il cervello RNA, creare una curva standard (serie consecutiva di 4-diluizioni) come segue: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, e nessun controllo di modello (NTC) .
          2. Per ogni diluizione, eseguire 1 ml cDNA a duplicazionete per ciascuna concentrazione di primer, (cioè, 100 nm, 200 nm, 300 nm).
        3. Verificare che tecnico replica dare coerente valori Ct.
        4. Esaminare i valori Ct per la curva di diluizione.
          1. Riportare i valori Ct contro la concentrazione per ciascuna delle diluizioni. Il grafico risultante deve essere lineare, con un buon coefficiente di correlazione (cioè> 0,95).
        5. Esaminare fondere curva per confermare la presenza di un singolo prodotto di amplificazione (ovvero, unico picco).
          1. Se ci sono picchi multipli, o le cime non sono simili, questo potrebbe suggerire contaminazione, mispriming, innesco-dimero artefatto, ecc (fig. 5).
          2. A picco nel NTC probabilmente corrispondono a dimeri primer forma più facilmente, in assenza di modello cDNA, e non deve essere una preoccupazione.
        6. Conferma fusione curva dei dati, risolvendo prodotti amplificati su un gel di agarosio all'1%.
          1. Preparare un 1% gel (per un volume di 100 mL)
            1. Pesare 1 g di agarosio in un pallone.
            2. Aggiungere 100 ml di 1x Tris-Acetato EDTA (TAE) tampone e forno a microonde fino agarosio è sciolto e la soluzione è chiara.
              1. 1 L 50x TAE buffer consiste di 2 M Tris di base, 57 ml di acido acetico glaciale, e 0,05 M EDTA (pH 8,0).
              2. Diluire il tampone TAE a 1x con acqua distillata (concentrazioni finali: 40 mM Tris-acetato e 1.0 mM EDTA).
            3. Lasciare raffreddare gel a 55 ° C prima di aggiungere il bromuro di etidio ad una concentrazione di 0,5 mg / ml.
            4. Versare il gel nel cast vassoio e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente.
          2. Per eseguire, gel posto nella camera di elettroforesi pieno di 1x TAE, unire 10 ml di campione dalla piastra qPCR con 2 l di loading dye 6x, mescolare bene e caricare nei pozzetti accanto ad una scala di peso molecolare.
          3. Elettroforesi a 50-150 volt fino marcatori sono migrati una distanza appropriata, a seconda delle dimensioni previste del prodotto cDNA.
          4. Visualizzare con un transilluminatore UV.
          5. Verificare che il prodotto amplificato PCR è di dimensioni adeguate per la vostra destinazione.
          6. Dimeri fondo sarà di circa 50 bp.
    2. Pre-schermo per una maggiore TNF-α.
      1. Dal momento che il TNF-α avvia reazioni dell'infiammazione in periferia, abbiamo il sospetto che questo vale anche per il cervello e l'utilizzo di screening iniziale per il TNF-α mRNA come indicatore dello stato della cultura fetta immunitario (cioè, normale, finzione, e gruppi sperimentali) prima di procedere alla piena analisi serie PCR.
      2. Se normale e finzione controllo TNF-α livelli di mRNA non sono all'interno di un intervallo di interassay trovato all'interno del nostro laboratorio, esperimenti (cioè, normale, finzione, e gruppi sperimentali) vengono scartati e non procedere alla completa analisi serie PCR.
      3. iScript sintesi del DNA.
        1. Per ogni campione di RNA, combinare le seguenti in un tubo di PCR: 4 mix microlitri di reazione 5x, 1 trascrittasi inversa microlitri, 25 ng di RNA, e RF H ​​2 O ad un volume finale di 20 l.
        2. Mescolare delicatamente pipettando e spin down brevemente.
        3. Incubazione: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 min.
        4. Diluire 1:4 (aggiungere 60 microlitri RNasi acqua libera).
        5. Conservare a -20 ° C o di tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso in poche ore.
      4. qPCR per il TNF-α.
        1. Preparare una master mix per ogni coppia di primer.
          1. Combina 12,5 microlitri iQ SYBR green, 1 mix fondo microlitri e 10,5 microlitri di acqua per campione.
          2. Sia per i nostri Rpl13a e TNF-α primer, 200 nM è la concentrazione ottimale.
          3. Regolare la quantità di primer e volume di waster come necessaria in una microcentrifuga 1,5 ml tubo RF e tenere sul ghiaccio mentre si imposta la piastra.
        2. Impostare un piatto qPCR con controlli / Shams / sperimentale a. Usare 1 l di cDNA campione per in duplice copia per ogni gene.
        3. Aggiungere 24 ml di vostro master mix in ciascun pozzetto e pipettare su e giù per mescolare.
        4. Essere molto attenti per evitare bolle, in quanto interferiscono con letture di fluorescenza.
        5. Eseguire 40 cicli di PCR:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 cicli: 95 ° C, 10 sec, 60 ° C, 30 secondi; 72 ° C, 20 sec / ciclo.
          3. Melt curva: 55 ° C, 1 min; 80 cicli di 0,5 ° C con incrementi di 10 secondi ciascuna a partire da 55 ° C.
      5. Analizzare i dati (metodo ΔΔCt;. Fig. 4) 13.
  6. sintesi del DNA per gli array PCR.
    1. Calcolare il volume (mL) di ogni campione per avere 250 ng di RNA.
      1. Scegli una quantità di RNA (100 ng a 1 mcg) che si può sempre estrarre dai campioni.
    2. RT 2 Kit prima parte - secondo le istruzioni del produttore. In breve:
      1. Scongelare e spin giù tutti i reagenti.
      2. Per ogni campione di RNA, combinare le seguenti in un tubo di PCR:
        1. 250 ng di RNA, 2 l di DNA genomico 5x (gDNA) tampone eliminazione e acqua ad un volume finale di 10 L.
      3. Mescolare delicatamente pipettando e spin down brevemente.
      4. Incubare a 42 ° C per 5 min.
      5. Freddo in ghiaccio per 1 min.
      6. Nel frattempo, preparare la trascrizione inversa (RT) cocktail (per esempio):
        1. Combinare 4 ml di tampone 5x RT 3, 1 fondo microlitri e mescolare controllo esterno, 1 ml RT mix enzima 3, e 3 ml di acqua.
      7. Aggiungere 10 ml di cocktail RT ad ogni campione e mescolare delicatamente.
      8. Incubare a 42 ° C per 15 minuti.
      9. Fermare la reazione di incubazione a 95 ° C per 5 min.
      10. Aggiungere 91 ml di RF H ​​2 O per ogni reazione 20 l sintesi del DNA (diluita ad un volume finale di 111 mL).
      11. Mescolare bene pipettando.
      12. Conservare a -20 ° C o di tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso in poche ore.
  7. RT 2 Profiler PCR array.
    1. Seguire le seguenti istruzioni del fabbricante e sono ribadito qui per comodità.
    2. Preparare i reagenti
      1. Scongelare e spin giù tutti i reagenti.
      2. Preparare cocktail sperimentale:
        1. Combina 1350 ml di 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, 102 ml di cDNA diluito e il 1248 l di RF H ​​2 O ad un volume finale di 2700 microlitri.
      3. Rimuovere con cautela serie PCR di busta sigillata.
      4. Dispensare cocktail in un serbatoio di carico.
      5. Aggiungere 25 microlitri di ciascun bene con un pipettatore multicanale.
      6. Attentamente tenuta PCR serie piatto.
      7. Centrifugare la piastra a 10.000 rpm per 1 min a temperatura ambiente.
      8. Mettere in ghiaccio fino al programma PCR è pronto.
    3. Eseguire il programma appropriato ciclismo per la vostra macchina.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 min
        2. 40 cicli: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 1 min.
        3. Melt curva: 55 ° C, 1 min; 80 cicli di 0,5 ° C con incrementi di 10 secondi ciascuna a partire da 55 ° C
    4. Analizzare i dati.
      1. Selezionare "Auto calcolati" per i cicli di base.
      2. Selezionare "User Defined" per la posizione della soglia di impostare manualmente il valore di soglia.
        1. In "View Log", soglia impostata nella parte inferiore di un terzo della fase lineare della trama di amplificazione.
        2. Essere sicuri di mantenere lo stesso valore di soglia più esecuzioni.
      3. Esportazione dei dati.
      4. Input in un file Excel.
      5. Carica su Array SABiosciences PCR Analisi dei dati.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. Selezionare i geni di riferimento - abbiamo usato Rpl13a.
      6. La nostra pratica è quello di:
        1. Confermare i risultati con almeno una vasta duplicare PCR.
        2. 3-fold cambiamenti serie non devono essere confermata da amplificazione del bersaglio successivo specifico PCR. 6,7
        3. Cambiamenti meno di 3 volte deve essere confermata da amplificazione obiettivo successivo specifico PCR o l'utilizzo di 2-3 array PCR (per confermare le modifiche 2x.
    5. Pre-amplificazione del DNA viene utilizzato per analizzare gli obiettivi attesi con ultra-low espressione (Fig. 6).
      1. SABiosciences di RT 2 Nano kit PREAMP sintesi del DNA e miscele fondo sono destinati per la pre-amplificazione di RNA per permettere l'uso di piccole quantità (1-100 ng) di RNA campione per eseguire una serie completa di PCR.
      2. Ciascuna miscela di primer consente l'amplificazione di 89 geni specifici modelli cDNA bersaglio di pregiudizi minima. Abbiamo usato questo sistema come un mezzo per amplificare i segnali di basso livello come IFN-λ ad un livello misurabili.
      3. RT 2 Nano kit PREAMP sintesi del DNA - secondo le istruzioni del produttore. In breve:
        1. Scongelare e spin giù tutti i reagenti.
        2. Per ogni campione di RNA, combinare le seguenti in un tubo di PCR.
          1. 1-100 ng di RNA, 2 ml di buffer 5x eliminazione gDNA e acqua ad un volume finale di 10 L.
        3. Mescolare delicatamente pipettando e spin down brevemente.
        4. Incubare a 42 ° C per 5 min.
        5. Freddo in ghiaccio per 1 min. Nel frattempo, preparare il cocktail RT (per campione).
          1. Combinare 4 ml di tampone 5x RT 3, 1 fondo microlitri e mescolare controllo esterno, 1 ml di cDNA mix sintesi enzimatica, 1 inibitore microlitri RNasi, e 3 ml di acqua.
        6. Aggiungere 10 ml di cocktail RT ad ogni campione e mescolare delicatamente.
        7. Incubare a 42 ° C per 15 minuti.
        8. Fermare la reazione di incubazione a 95 ° C per 5 min.
        9. Conservare a -20 ° C o di tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      4. amplificazione del DNA con primer specifici.
        1. Mescolare la seguente in un tubo di PCR:
          1. 12,5 microlitri PCR Master Mix, 7,5 microlitri primer specifico, e 5 ml di cDNA diluito.
        2. Eseguire 12 cicli di PCR.
          1. 95 ° C, 10 min.
          2. 12 cicli di: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 2 min.
          3. Mantenere a 4 ° C.
        3. Aggiungere 2 microlitri riduttore di reazione laterali per ogni campione.
        4. Incubare a 37 ° C per 15 min.
        5. Fermare la reazione di incubazione a 95 ° C per 5 min.
        6. Aggiungere 84 microlitri di acqua per ogni reazione RF 27 microlitri di amplificazione del DNA.
      5. Conservare a -20 ° C o di tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso in poche ore.
      6. Amplifica obiettivi singolo gene utilizzando Regìa primer e SYBR green master mix come descritto sopra.

4. I dosaggi Phosphoprotein multiplex di segnalazione delle citochine

  1. Saggi fosfoproteina Mutliplexed sono usati per definire citochine ligando-recettore a valle di segnalazione (Fig. 7).
  2. Determinare la quantità di proteine ​​totali nelle culture fetta.
    1. Culture raccolta fetta da sollevando delicatamente le fette di inserti e fuori luogo in 1 ml di freddo (4 ° C) PBS.
    2. Centrifugare le provette per 30 secondi e rimuovere PBS. Mettere in ghiaccio secco fino al termine della raccolta.
    3. Conservare a -80 ° C.
  3. Omogeneizzare le culture fetta di dosaggio proteine ​​totali.
    1. Preparare buffer di lisi cellulare in base alle istruzioni del produttore.
      1. Aggiungi inibitori della proteasi per un volume totale di tampone necessario mettere almeno 200 ml di tampone di lisi su ogni fetta di cultura.
        1. Per esempio: aggiungere 20 ml di Fattore 1, 10 ml di Factor 2, e 20 ml di 500 mM in DMSO PMSF al 4,95 buffer di lisi cellulare ml.
    2. Disgelo culture fetta in 200 microlitri tampone di lisi sul ghiaccio.
    3. Sonicare culture fetta cinque volte in 1 sec e legumi posto immediatamente tornare sul ghiaccio.
    4. Campioni vortex per 10 sec.
    5. Centrifugare i campioni a 4 ° C per 15 minuti a 13.000 giri al minuto.
    6. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e tenere in ghiaccio.
  4. Eseguire test proteine ​​totali.
    1. Preparare gli standard proteine.
      1. Magazzino ricostituire albumina di siero bovino (BSA), secondo le istruzioni del produttore.
      2. Preparare norme che vanno 0-1000 mg / ml diluito in acqua ad elevata purezza per analisi di proteine ​​BCA.
    2. Calcolare il volume di reagente di lavoro necessario in base al numero di campioni e di repliche.
      1. Per esempio: (8 standard + 18 campioni sconosciuti) x (2 repliche per campione) x (0,2 ml di reagente di lavoro necessario per pozzetto) = 10,4 mL di volume totale necessario per tutti i campioni caricati sul micropiastre.
        1. Tondo fino a 12 ml di volume totale per garantire un volume sufficiente.
      2. Quando la miscelazione dei reagenti A con B Reagente per il reagente di lavoro, alcuni torbidità si possono verificare, ma dovrebbe scomparire a breve.
    3. Carico di 10 L di campioni e gli standard per bene.
    4. Carico di 0,2 ml di reattivo di lavoro nei pozzi.
    5. Coprire la piastra con nastro adesivo ed agitare per 30 secondi per mescolare.
    6. Incubare piastra a 37 ° C per 30 min.
      1. Piastra raffreddare a temperatura ambiente (circa 10 min) prima di leggere su un lettore di piastre a 595 nm.
    7. Costruire una curva standard utilizzando Microsoft Excel con assorbanza misurata vs concentrazione attesa.
      1. Un buon coefficiente di correlazione è pari o superiore a 0,98.
    8. Calcolare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni utilizzando l'equazione lineare derivato dalla curva standard.
    9. Diluire i campioni in tampone di lisi per la stessa quantità di proteine ​​e conservare a -80 ° C fino al momento per ulteriori elaborazioni.
    10. Concentrazione di proteine ​​deve essere compresa 200-900 mg / ml in base alle istruzioni del produttore.
  5. Effettuare analisi Multiplex.
    1. Nota: saggi fosfoproteina multiplex prendere 2 giorni totali per completare, con 1 ora di set-up iniziale e il caricamento della lastra seguito da un giorno all'altro incubatoripasso incubazione e di incubazione e lavare ulteriori passi il giorno successivo.
    2. Mappa quale pozzi che conterrà lisato secondo foglio di lavoro in manuale.
    3. Scongelare i campioni di tessuto omogeneizzati e lisati kit a temperatura ambiente e poi posto sul ghiaccio. Portare tutti i tamponi e reagenti forniti nel kit a temperatura ambiente (ad eccezione di streptavidina e perline).
    4. Preparare perline per test multiplex.
      1. Tubi di copertina contenente microsfere accoppiato con foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Tubi vortex per 5 secondi e tenere in ghiaccio.
      2. Diluire perline accoppiate 1:50 in tampone di lavaggio.
        1. Ogni bene deve contenere 1 ml di perline accoppiate in 49 microlitri di tampone di lavaggio per un volume totale di 50 microlitri per pozzetto.
    5. Calibrare l'apparato vuoto.
      1. Lavare la piastra con 100 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto.
      2. Accendere il vuoto e di aspirazione fuori il liquido in eccesso entro 2-5 secondi.
        1. Se la rimozione completa del tampone prende più o meno lungo di 2-5 sec, regolare la valvola di conseguenza.
        2. Asciugare il fondo del piatto fondo prima di aggiungere campioni.
    6. Vortex le perline accoppiate diluito per 5 sec ed aggiungere 50 microlitri di pozzi designato.
      1. Immediatamente vuoto filtro e asciugare il fondo del piatto con un tovagliolo di carta.
    7. Lavare la piastra due volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto. Asciugare il fondo della piastra dopo ogni lavaggio.
    8. Vortex scongelati i campioni per 3 secondi e aggiungere 50 microlitri di pozzi designato. Luogo di tenuta del nastro sulla piastra e incubare per 15-18 ore in agitazione a 300 rpm a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    9. Aspiraliquidi filtro in eccesso e la piastra di lavare tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio. Asciugare il fondo della piastra dopo ogni lavaggio.
    10. Diluire 1:25 anticorpo in tampone di lavaggio.
      1. Ogni bene richiede 1 microlitri di rilevamento degli anticorpi in un volume totale di 25 microlitri di tampone di lavaggio.
    11. Luogo nastro adesivo sulla piastra e al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. Agitare per 30 secondi, aumentando gradualmente la velocità a 1100 giri al minuto. Continua agitazione a 300 rpm per 30 minuti a temperatura ambiente.
    12. Filtrare sotto vuoto il piatto e lavare tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio. Asciugare il fondo della piastra dopo ogni lavaggio.
    13. Proteggendo allo stesso tempo la piastra dalla luce, preparare una diluizione 1:100 di streptavidina-PE con volume sufficiente per aggiungere 50 microlitri per pozzetto. Proteggere la soluzione dalla luce.
    14. Vortex a fondo e aggiungere 50 microlitri diluito streptavidina-PE per bene. Incubare con agitazione a 1100 rpm per 30 secondi seguiti da 10 min a 300 giri al minuto.
      1. Vuoto tampone in eccesso filtro off.
      2. Lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di buffer risospensione per bene.
      3. Asciugare il fondo della piastra a fondo dopo ogni lavaggio.
    15. Aggiungere 125 microlitri di buffer risospensione in ciascun pozzetto ed agitare per 30 sec a 1100 giri al minuto.
    16. Leggere subito piastra o conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 24 ore.

5. Imitando e modulazione di segnalazione delle citochine

  1. Citochine proteine ​​ricombinanti (con supporto) sono utilizzati per simulare i cambiamenti di SD.
    1. Proteine ​​liofilizzato (ad esempio, il TNF-α) sono conservati fino ad 1 anno a -20 ° C.
    2. Dopo diluizione di una soluzione madre con 0,1% di sieroalbumina bovina, aliquote vengono preparati, conservati a -20 ° C, fino a usare entro 3 mesi.
    3. Ogni manipolazioni a culture fetta vengono aggiornati almeno ogni tre giorni.
  2. Segnalazione delle citochine è messo a tacere da:
    1. L'uso di citochine tradizionale segnalazione agenti farmacologici a cascata;
    2. L'uso di antagonisti ligando solubile [ad esempio, recettore solubile del TNF 1 (come descritto sopra per ligandi ricombinanti)], oppure
    3. Silenziamento genico [cioè, piccoli RNA interferenti (siRNA)].
  3. Consegna di siRNA per le cellule neuronali è spesso problematico.
    1. Comune a base di lipidi reagenti solito risultato in termini di efficienza di trasfezione bassa e perdita di vitalità cellulare.
    2. Invece, usiamo Thermo Scientific Dharmacon siRNA Accell, che consentono di knockdown alta efficienza senza uso di un reagente di trasfezione.
    3. Qui vi mostriamo knockdown di cyclophilin B, un non essenziali proteina espressa in tutti i tipi di cellule, come conferma l'utilizzo di questo metodo nelle culture fetta.
    4. Protocollo di recapito è stato adattato per le culture fetta da istruzioni del produttore per l'uso in cellule aderenti.
      1. Diluire il tampone 5x siRNA a 1x con acqua RNasi libero.
      2. Preparare una soluzione 100μM siRNA in 1x tampone
        1. Cyclophilin siRNA B è fornito a 5 nmol. Risospendere in 50 ml di tampone 1x per uno stock 100 mM.
      3. Mescolare con siRNA Accell consegna Medium ad una concentrazione finale di siRNA 1μM.
        1. Aggiungere 11 ml di 100 mM siRNA magazzino a 1100 l di media consegna Accell in un 6-pozzetti.
        2. Posto in incubatrice e consentire di equilibrare la temperatura a normali condizioni di incubazione per almeno 20 min.
      4. Utilizzando un BSL-2 cappuccio e tecnica sterile, inserisce il trasferimento nella miscela contenente consegna pozzi.
        1. Incubare con mix di consegna per 96 ore per knockdown proteine.
          1. Valutare knockdown proteine ​​mediante Western blot o intensificato immunocolorazione.
          2. Western blot, mentre una scelta potenziale prima per l'efficienza knockdown, potrebbe essere troppo sensibile per la segnalazione di basso livello immunitario associate con la non pregiudizievole fenomeno della SD.
          3. Di conseguenza, abbiamo seguito negativi nelle misurazioni della Western Blot con l'argento migliorata diaminobenzidina (DAB) immunocolorazione e computer basati su misurazioni di densitometria (vedi sotto).

6. Conferme proteomica

  1. Specificità delle cellule dei cambiamenti fosfoproteina avviene tramite immunocolorazione. 6,7
    1. Fix culture fetta per 24 ore con fissativo PLP composto da:
      1. 10 ml di paraformaldeide al 16%, 1,096 g di lisina, fosfato di sodio 0,42 g, periodato e 0,17 g di sodio, riempito per un volume totale di 80 mL con acqua ultrapura (fissante è di 6,2 pH).
      2. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente le culture fetta da inserti con un pennello fine e trasferimento in PBS contenente sodio azide (100 mg / L) fino al momento di sezione.
      3. Poi, incubare le fette di almeno 24 ore in PBS-20% di saccarosio, tagliare le culture fetta intera di 20 sezioni micron, e montare alle diapositive gel rivestito.
      4. Immunocolorazione fluorescenti (ad esempio, per NFκB) si ottiene come segue con tutte le misure accoppiate a scuotere a ~ 50 giri.
        1. Lavare le culture fetta in 3 ml di PBS per tre volte per 10 minuti.
          1. Collocare i vetrini con montate 20 colture fetta micron di vaschette Coplin con ~ 40 ml di PBS per tutte le fasi di lavaggio.
        2. Lavare le culture fetta in PBS per tre volte, a 10 minuti a lavaggio.
        3. Mettere qualche goccia di SFX potenziatore di segnale sulle culture fetta e incubare in camera umida per 30 min.
        4. Incubare culture fetta per 2 ore a 37 ° C con coniglio anti-NFκβ anticorpi a 1:100 diluito in 0,75% Triton X-100 in PBS.
          1. Aggiunta della soluzione di anticorpi direttamente su fette.
        5. Togliere le fette di soluzione di anticorpi e lavare tre volte in PBS per 10 minuti a lavaggio.
        6. Incubare fette a temperatura ambiente per un'ora in capra anti-coniglio AlexaFluor 594 anticorpi a 1:50 in 0,75% Triton X-100 in PBS.
          1. Centrifuga AlexaFluor 594 anticorpi per 15 minuti a 10.000 giri per rimuovere l'eventuale precipitato che possono essersi formate in soluzione.
        7. Lavare tre volte in PBS, 10 minuti a lavaggio.
        8. Immergere i vetrini in acqua distillata per sciacquare i sali da PBS.
        9. Coprioggetto con Prolungare media Antifade e lasciare asciugare per almeno 2 ore, coperto al riparo dalla luce.
        10. Visualizzare con tradizionale o confocale (Fig. 7) microscopia a fluorescenza.
  2. Cambiamenti produzione di proteine ​​da knockdown siRNA possono essere sensibilmente valutata attraverso il rafforzamento DAB tradizionali immunocolorazione 7 via intensificazione argento 16 e successive quantificazione densitometrica (per esempio, come mostrato qui per cyclophilin B) (Video Figura 2).
    1. Immunocolorazione per cyclophilin B segue le procedure standard per l'imaging in campo chiaro di recente abbiamo dettagliato, 7 utilizzando:
      1. Anti-topo cyclophilin B (1:100) per 24 ore a 4 ° C;
      2. Seguito, mediante l'etichettatura degli anticorpi perossidasi del rafano secondario (1:100);
      3. E DAB visualizzazione.
    2. f le reazioni DAB sono troppo deboli per consentire digitale quantification17 densitometrico, possono essere intensificati con una procedura d'argento differenziati a seconda Quinn e Graybiel 16.
      1. Reidratare diapositive e poi lavare x 3 per 10 minuti in acqua ad elevata purezza.
      2. Collocare i vetrini in acqua ad elevata purezza in una vaschetta Coplin e calda a 56 ° C.
      3. Preparare una soluzione ammoniacale di nitrato d'argento (0,5%):
        1. Cloruro di ammonio magazzino (25-30%) è appena diluito (1:1) con acqua ad elevata purezza.
        2. Aggiungere idrossido di ammonio (~ 500-600 microlitri per 100 ml) goccia a goccia mescolando alla soluzione di nitrato d'argento allo 0,5% che sarà brevemente volta nuvoloso e quindi cancellare.
        3. Riscaldare la soluzione a 56 ° C.
        4. Incubare sezioni per 10-12 min.
      4. Lavare i vetrini per 15 secondi in acqua ad elevata purezza (questo e tutti i passi successivi vengono eseguiti a temperatura ambiente utilizzando vaschette Coplin).
      5. Immergere i vetrini per 15 secondi in tiosolfato di sodio 1% (pentaidrato).
      6. Immergere i vetrini per 15 secondi in acqua ad elevata purezza.
      7. Tono le diapositive per 2 minuti in cloruro d'oro 0,2%.
      8. Immergere i vetrini in acqua ad elevata purezza per 15 sec.
      9. Esporre le diapositive di 0,5% di acido ossalico per 2 min.
      10. Immergere i vetrini per 15 secondi in acqua ad elevata purezza.
      11. Trattare le diapositive per 5 min in tiosolfato di sodio al 5%.
      12. Lavare i vetrini completamente in acqua ad alta purezza, disidratano e coprioggetto.
      13. Le diapositive sono ora pronti per la quantificazione densitometrica 17.
        1. Tutte le attrezzature, compresa l'illuminazione in campo chiaro, è attivata per almeno 20 minuti prima di imaging.
        2. Interi quartieri cultura fetta vengono esposte a 5-10x su un microscopio invertito.
        3. L'intensità della luce è impostato su un livello uniforme (ad esempio, ~ 2,6 V) e non è cambiato durante tutte le acquisizioni delle immagini.
          1. I filtri a densità neutra sono utilizzati come necessari per ridurre l'immagine full trasmessa l'intensità della luce a ~ 1500 a 12-bit scala (0-4095) dove "0" è completamente nero e 4095 è completamente bianco.
        4. Le immagini digitali vengono poi acquisiti e conservati elettronicamente per tutti (cioè, farsa di controllo e campioni sperimentali), compresa una immagine di sfondo deriva forma una zona del vetrino senza sezioni cultura fetta.
        5. L'immagine di sfondo viene sottratto da tutte le immagini (sham e sperimentali) e una zona di interesse (AOI) disegnato intorno ad ogni fetta di cultura e trasmessa l'intensità della luce registrata.
        6. Intensità del campo dell'immagine è impostata su una serie costante per tutti gli esperimenti.
        7. Per chiarezza, risultante espressa come una densità relativa rispetto ai livelli di controllo (Fig. 8).

7. Rappresentante dei risultati:

Figura 1
Figura 1. Cultura fetta elettrofisiologiche paradigma di registrazione. Microelettrodo registrazione è prima posizionato al livello dei neuroni piramidali CA3 e poi un elettrodo bipolare stimolante è posto nel giro dentato (DG).

Figura 2
Figura 2. CA3 potenziali evocati campo e sinapticamente indotto diffondere la depressione. (A) Esperimenti inizia con la determinazione della corrente necessaria per massimizzare il livello di campo CA3 risposte potenziale area e poi a metà massima intensità è usato per indurre potenziali di campo CA3 zona evocati. Ciò documenta la normalità di evocate risposte sinaptiche tra i preparati. Se potenzialità inviare una fetta di campo eccitatoria sinaptiche non sono almeno 3 mV, le fette vengono scartati. (B) Successivamente, soglia trans-sinapticamente evocato per innescare la depressione diffusione è determinato (a destra, la lentezza delle risposte), mentre le potenzialità stesso campo di tempo (a sinistra , risposte rapide) sono utilizzati per documentare che i preparativi sono abbastanza sano da seguire stimolazione 10 Hz (ad esempio, ampiezze delle deviazioni verticali in rapida record potenziali sono simili).

Figura 3
Figura 3. Movimento microglia associato ad una ridotta attività sinaptica. Evidenza mostra che i rami della microglia e chiudere con un aumento dell'attività sinaptica, ma a lunga distanza il movimento di queste cellule in risposta all'attività sinaptica non è stata descritta nel cervello illeso. I nostri risultati utilizzando fluorescenti etichettatura isolectin B4 di spettacolo microglia che una frazione di queste cellule si muovono lunghe distanze in condizioni normali. Inoltre, il numero di questi microglia viaggiare è significativamente aumentata quando l'attività sinaptica è abolita da esposizione cultura tetrodotossina, come mostrato nell'immagine allegata. Linee rosse marchio sentieri percorsi dalla microglia in un periodo di 6 ore con le frecce blu che segna l'origine di un microglia pochi esemplari. Calibrazione bar, 50 micron.

Figura 4
Figura 4. PCR di screening attività. (A) Noi utilizziamo TRIzol con kit Qiagen per l'isolamento di RNA in quanto, nelle nostre mani, il risultato è significativamente maggiore (p <0,001, t-test). Resa RNA da culture fetta ippocampale di utilizzo del kit di Qiagen solo (B) Inoltre, periodicamente, confermano che le nostre procedure di estrazione di RNA produrre RNA di alta qualità intatta, come determinato attraverso un gel che mostra forte bande di RNA. (C) Noi utilizziamo il software NormFinder di scegliere un gene di riferimento con un valore migliore stabilità. Per esempio, le culture fetta espostia lipopolyssacharide (100 ng / mL per 2 ore) sono stati analizzati per tre geni di riferimento (Rpl13a, β-actina, 18s). Valori Ct vengono utilizzati per calcolare un valore di stabilità. I nostri dati qui [e che per altri esperimenti utilizzando la depressione diffusione (dati non riportati)] dimostrano che Rpl13a è un gene di riferimento ottimale. (D) Usiamo il metodo "ΔΔCt" come mezzo sensibile e riproducibile per rilevare fold-change RNA differenze tra i gruppi sperimentali e controlli farsa.

Figura 5
Figura 5. Reazione PCR controlli. (A) Misuriamo amplificazioni curva di diluizione per primer come mezzo per verificare la qualità delle reazioni PCR. Per esempio, amplificazioni ottimale mostrano una uniforme (1-5) aumento della soglia Ct. (B), invece, amplificazioni non sono uniformi con primer poveri (1-5). (C) Inoltre, noi dobbiamo fare una curva di fusione alla conclusione di PCR per confermare che gli ampliconi desiderati vengono rilevate (cioè, una curva solo picco), che indica l'assenza di DNA a doppia elica compresa dimeri primer, contaminazione del DNA e misannealed prodotto della PCR (che appaiono come curve di punta multiple).

Figura 6
Figura 6. Nano di pre-amplificazione permette la rilevazione di IFN-λ nelle culture fetta ippocampale. Poiché solo ~ 50 T-cellule si trovano in una cultura fetta (su ~ 55,000-90,000 cellule totali), abbiamo usato la RT 2 nano Kit PREAMP sintesi del DNA come un mezzo per rilevare potenziali ultra-basso livello di espressione di IFN-λ. Questo mezzo di preamplificazione cDNA fornito a 12 volte maggiore sensibilità ad RNA livelli. I risultati sopra indicato illustrare la capacità di preamplificazione per aumentare la sensibilità di rilevazione. Ct soglia di riferimento gene Rpl13a è stata del 20,5 con amplificazione iniziale e questo è stato aumentato al 14,1 con l'utilizzo del kit preamplificazione, 12 volte il corrispondente aumento di 12 cicli di amplificazione di cDNA. In parallelo, IFN-λ Non è stato rilevato (0,0), ma era ben a portata di rilevazione (29,0) con preamplificazione.

Figura 7
Figura 7. Innata citochine percorso fosfoproteina fosforilazione modifiche. (A) effetto esemplare di TNF-α pre-trattamento (cioè, neuroprotezione) su innata fosforilazione fosfoproteina percorso citochina 24 ore dopo l'infortunio eccitotossico nelle culture fetta dell'ippocampo. I risultati mostrano CA1 cambiamenti zona tra fette pretrattati per 3 giorni con 100 ng / mL TNF-α prima esposizione a N-metil-D-aspartato (NMDA) rispetto a quelli esposti a NMDA da solo (cioè sperimentale vs finto) espresso in percentuale. Si noti che TNF-α indotta da un aumento sostenuto fosforilazione di JNK e ATF-2, nonché un aumento transitorio NFκB. (B) La distribuzione spaziale di attivazione NFκB (ad esempio, presenza di NFκB fosforilata nel nucleo) è rivelato da immunocolorazione ( rosso). YoYo macchie verdi nuclei in una sezione cultura fetta [ad esempio, negli astrociti (freccia testa)]. Neuroni piramidali, che altrimenti appaiono anche verde, giallo sono invece a causa della concomitante marcatura con fosforilato NFκB (rosso). Calibrazione bar, 25 micron.

Figura 8
Figura 8. . Proteomica conferma di efficienza siRNA intensificazione argento differenziata della perossidasi-diaminobenzidina immunocolorazione based per cyclophilin B mostra che siRNA può significativamente (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak metodo) ridurre globale dell'ippocampo espressione fetta cyclophilin B 3 giorni dopo l'applicazione della 200, 500 , o 1.000 siRNA nM.

Discussion

SD è una perturbazione parossistica del cervello le cui caratteristiche sono altamente conservati in tutte le regioni le specie ed il cervello esaminati fino ad oggi. SD è comunemente studiate in neocorteccia. Tuttavia, la complessità del circuito neurale di questa struttura (rispetto a ippocampo), così come l'incapacità di mantenere in vita neocorteccia in vitro con funzioni immunitarie quiescenti per lunghi periodi, rende meno utile come preparazione in vitro per la definizione delle conseguenze a lungo termine di suscettibilità SD. Al contrario, ippocampo è non solo la struttura del cervello che è più sensibile a SD, è anche una struttura archicortical con una struttura più semplice circuito neurale e la funzione, che ben si adatta per definire i mezzi neuroimmune con cui l'attività neurale in grado di modulare la suscettibilità SD .

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NS-19.108), l'Istituto Nazionale di Salute Infantile e Malattia (PO1-HD09402), la Fondazione per la Ricerca e la Fondazione Emicrania Bianca. La signora Marcia P. Kraig assistito nella preparazione e manutenzione di sistemi di coltura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium

Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes

Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup

Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures

Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification

Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening

Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay

Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry

Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

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References

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  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, (1), 26-43 (1997).
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  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, (1), 93-108 (1996).
Modellistica neurale segnalazione immunitario di emicrania episodica e cronica utilizzo Depressione Diffusione<em> In Vitro</em
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Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

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