Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Yayılma Depresyon Episodik ve Kronik Migren Sinir Bağışıklık Sinyalizasyonu Modelleme In Vitro Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
* These authors contributed equally

Summary

Migren ve kronik migren, dönüşüm, gelişmiş tedavi seçenekleri ihtiyacı büyük sağlık yükleri vardır. Biz modellenen, sinir bağışıklık sinyalizasyon migren duyarlılık modüle nasıl tanımlamak isteyen

Abstract

Migren ve kronik migren, dönüşüm, gelişmiş tedavi seçeneklerine ihtiyaç sağlık yükleri. Biz sinir bağışıklık sinyalizasyon, epizodik ve kronik migren için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için bir araç olarak, yayılan depresyon (SD) ile in vitro olarak modellenmiş migren, duyarlılık modüle nasıl tanımlamak için çalışırlar . SD, migren aurası ve migren ağrısı muhtemel nedenidir. Paroksismal duyarlı beyin bölgeleri içinde yavaş yavaş yayar başlangıçta artmış nöronal aktivite ile tetiklenen nöronal fonksiyon kaybıdır. Normal beyin fonksiyonu için zarif hassas ve üzerinde tesadüf düşük düzeyde bağışıklık sinyal dayanır. Böylece, nöral bağışıklık sinyalizasyon muhtemelen elektriksel aktivite SD etkiler ve bu nedenle migren. Bütün hayvanlar SD Ağrı algılama çalışmaları, zorluklarla dolu, ancak bütün hayvanlar iyi SD trigeminal nosiseptif yolları aktive beri migren sistemleri biyoloji yönlerini incelemek için uygundur. Ancak, tek başına tüm hayvan çalışmaları deşifre SD hücresel ve sinirsel devre mekanizmaları kullanılabilir. Bunun yerine, çevre koşulları kontrol edilebilir, in vitro hazırlıkları gereklidir . Burada, akut dilimleri ve hipokampal dilim kültürlerin farklı avantajları sınırlamaları tanımak için önemlidir. Akut beyin dilimleri tetikler yalnız dilim hazırlanıyor beri bağışıklık sinyal ince değişiklikler ortaya: pro-inflamatuar değişiklikler, son günlerde, dilim canlandırmak için gerekli yüksek düzeyde oksijen gerginlik nedeniyle epileptiform davranış ve anoksik dilim merkezlerinde geri dönüşümsüz hücre hasarı.

Latent astrositler, mikroglia ve sitokin düzeylerini göstermek; kültürleri yakından olgun trisynaptic fonksiyonu ile in vivo meslektaşı paralel yana aksine, biz olgun hipokampal dilim kültürlerde bağışıklık sinyal incelemek ve SD unanesthetized bir hazırlık kolayca indüklenir. Ayrıca, dilimleri uzun ömürlü ve SD, yaralanma olmadan bu hazırlık tek aracı kronik SD neuroimmune sonuçları modelleme yeteneğine güncel haline ardışık gün indüklenen olabilir ve bu nedenle belki de kronik migren. Elektrofizyolojik teknikler ve non-invaziv görüntüleme nöronal hücre ve SD tesadüf devre fonksiyonları ölçmek için kullanın. Sinir bağışıklık gen ekspresyonu değişkenleri (lazer diseksiyon mikroskobu ile) qPCR tarama, qPCR diziler, ve daha da önemlisi, cDNA amplifikasyon, tüm bölgesel, ya da belirli bir hücre gelişmiş kullanarak, interferon-gamma gibi ultra-düşük seviyesi hedefleri tespit için kullanımı ile ölçülür. örnekleme. Sitokin kaskad sinyalizasyon hücre-spesifik immün ile teyit çoğullanır gen ekspresyonu phosphoprotein ilgili tespit edilen hedefler ve phosphoprotein değişiklikleri ile değerlendirildi. Farmakolojik ve siRNA stratejilerini taklit ve SD bağışıklık sinyalizasyon modüle etmek için kullanılır.

Protocol

Beyin dilimleri bağışıklık ilgili SD sinyal başarılı çalışma için vurgulanması gereken birkaç nokta. İlk olarak, uyaranlara başlatılması, eş zamanlı olarak gri cevherde beyin SD başlatmak için yeterli bir hacim depolarize gerekir. Bu arabirimi yapılandırma gereklidir (örneğin, dilim kültür eklemek yukarıda sıvı yalnızca aşağıda pozlama ve gaz değişimi) anlamına gelir. 1,2 İkincisi, akut beyin dilimleri SD ancak bunların hazırlanması travma, yanı sıra, 95% oksijen gazlı kullanımı sürdürmek hipokampal dilim kültürleri bu akut dilim sınırlamaları aşmak Ringer solüsyonu, nöral devre fonksiyonu ve bağışıklık homeostazı değiştirebilirsiniz. 3. Üçüncü sırasıyla pro-inflamatuvar değişiklikler ve epileptiform davranış oluşturmak, dilim kültürler önce yeterli süreler için devam gerektiğine dikkat etmek önemlidir mikroglia ve astrositler latent hale gelmesi için (yani, 10 gün daha fazla in vitro) 3-5 Sonunda, SD steril ve aseptik teknikler kullanılarak uyarılan olmalıdır. Aşağıda belirtilen teknikler, bu ihtiyacı karşılayacak şekilde tasarlanmıştır.

1. Dilim Kültürler Depresyon Yayılma

  1. Kültür hazırlanması ve bakımı.
    1. Dilim kültürler orta küçük değişiklikler ile daha önce 8 açıklanan at serum tabanlı orta veya serum orta (SFM) 6,7 hazırlanır ve muhafaza edilir . İnkübasyon parametreleri 36 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem dengesi hava.
      1. Kültürleri, in vitro 18 gün sonra bir SFM açık ve ekstra kalsiyum ve magnezyum içerir önceden tanımlanmış SFM kullanımı ile in vitro olarak en az 35 gün muhafaza olduğunu bulabilirsiniz .
      2. Buna ek olarak, antibiyotik ve bir antifungicide birden fazla kayıt atakları ile ilişkili enfeksiyon bulaşmasını önlemek için eklenir.
      3. Bu uzun vadeli (veya kayıt) orta formülasyon içeren (100 ml başına): Neurobosal orta, 97 mL; Gem-21, 2.0 ml; Glutamax (200 mM), 0.5 mL; Gentamisin (10 mg / ml), 10 mcL; D-glukoz (% 45), 680 mcL, askorbik asit (0.5 M), 100 mcL; Fungizone (250 mg / ml), 400 mcL NaCl (5.0 M), 820 mcL, Mg 2 Cl 2 (1.0 M) 80 mcL CaCl 2 (1.0 M), 160-240 mcL.
      4. Kültürler, in vitro 21-35 gün SD için kullanılır .
    2. Canlılık doğrulama. 3,6,7
      1. Kültürler kullanmadan önce piramidal nöron ölümü kanıt gösterildi.
        1. In vitro olarak 18 gün, 5 mcM Sytox Yeşil, DNA (yani, ölü hücrelerin içine nüfuz ederek) bağlanır floresan olur bir marker içeren ortamda 20 dakika (normal inkübasyon koşulları altında) ekler inkübe edilir.
        2. Uçlar sonra önceki ortamına aktarılır ve CA3 veya CA1 piramidal nöron tabakası yaralanma kanıt floresan mikroskobu (504 uyarma ve emisyon 523) ile incelendi.
          1. Dilimler daha sonra kullanmak 20'den fazla hücre veya 250 IU daha floresan daha fazla standart bir seviye ile dışlandı.
  2. Malzeme imalatı.
    1. Zemin elektrotlar cam tüpler (2.0 mm OD / 1.16 mm ID) 4.5 mm boylarda kesim ile yapılan ve kısaca her iki ucunda cilalanmış.
      1. Biz, bir yıldan fazla sürebilir bir süre yaklaşık 20 elektrot olun.
      2. 100 mL 1M KCl kaynamaya getirin ve net bir sarı çözüm üretmek karıştırma, 3.5 g agar ve 0,5 gr EDTA (ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu dihidrat) ekleyin.
      3. Esnek borular, cam tüpler yanı sıra esnek borular içine kısa bir mesafe içine sıcak KCl / agar çözüm çekmek için her bir cam tüp üzeri kısa bir uzunlukta kullanın.
        1. Yayın emme ve KCl / agar bir cam tüp açık ucu yavaş damla izin; sonra bir buz parçası karşı açık cam tüp ucu tutun.
        2. Ikinci manevra elektrot ucu agar jel hızlı ve jel cam tüpe geri uzaklaşıyorsun.
      4. Akan soğuk su içinde agar jel sonra, esnek bir tüp, cam tüp içinde yerleştirilmiş agar değiştirmeden silinebilir.
      5. Yeri 0.5 ml, 1.5 ml santrifüj tüpüne raf her kuyuya 1 M KCI. Sonra bir ucu bireysel kuyularda her agar / KCl dolu cam tüp yerleştirin.
      6. Sonraki 15 gauge gümüş tel 80 cm uzunluğunda bir hemostat tutun ve her dört tarafı karşı üst düzenlenen bir Emery kurulu ile tel kazıma temiz.
      7. 4 cm uzunlukta tel kesin ve temizlenmiş gümüş yüzey üzerinde sağlam bir Ag-AgCl kat yere 20-30 dakika çamaşır suyu ile dolu bir sintilasyon şişenin içine koyun.
      8. Yarısında her tel bükün ve wi dolu cam tüpün bir ucunu serbest uçları eklemekth KCl / agar, yaklaşık 4-6 mm maruz bırakarak.
      9. Son olarak, ceket, gümüş tel ve goop ile tel KCl / agar kurumasını önlemek için küçük bir oranda, suya dayanıklı ve esnek bir yapıştırıcı, içeren cam tüp sap. Elektrotlar için tekrarlayın. Tutkal gecede kurumasını bekleyin.
      10. 4 elektrotlar Mağaza ° C sintilasyon şişeleri (5-6 elektrotlar / flakon) ~ 5 mL 1 M KCl ve belirgin bakteriyel büyümeyi yavaşlatır EDTA, 25 mg içeren.
    2. Filamentler (Video Şekil 1) ile borosilikat cam tüpler; Kayıt elektrotları, 1.5 mm çapa (10 cm uzunluğunda, 0,86 mm ID) yapılır .
      1. Kısa cam tüpler ile ince bir ucu keskin bir noktaya çekti Mikroelektronlar çekin.
        1. Biz genellikle elektrotlar çekin bir 1 cm konik ile 7.5 cm uzunluğunda. Bu yeterli konumlandırma ve elektrot ucu görselleştirme sağlar.
        2. Elektrotlar bir Narishige PE-2 çektirmesi ile çekilmektedir.
        3. Mikroelektrod ipuçları, kalibre edilmiş bir optik mikrometre ile donatılmış bir bileşik mikroskop kullanılarak görüntü altında 2-4 mikron geri kırık. Biz, standart bir cam histoloji slayt kenarı (25 x 75 x 1 mm), mikroelektrot uçları hafifçe kırmak için başka bir 3-boyutlu manipülatör tarafından düzenlenen tek boyutlu bir hidrolik mikromanipülatör bağlı.
          1. İlk olarak, kil kullanarak bir mikroskop lamı bağlı elektrot monte edilir.
          2. Sonra slayt, hidrolik manipülatör bağlı kaydırdı cam kenarına yakın mikroelektrot ucu taşımak için kullanılan mikroskop lamı tutucuya yerleştirilir.
          3. Son olarak, mikroelektrot ucu hafifçe hidrolik tahrikli mikroskop lamı kenarına basarak bozuldu.
    3. Uyarıcı elektrot çünkü bükülmüş tel bipolar elektrotlar:
      1. Onlar, aksi takdirde monopolar stimülasyon uyaran artifakı tarafından karartılmış olacaktır, uyarılmış alanında potansiyeller, kayıt izin verir.
      2. Bir bipolar uyarıcı elektrot, sivri uçlu bipolar elektrotlar aksine hafifçe, yaralanma olmadan dentat girus yüzeye uygulanabilir.
      3. Son olarak, uygulanan akım elektrot için kullanılan Teflon izoleli teller enine (çıplak) dairesel yüzeyler lokalize olur.
        1. Ve Teflon kaplı tel; Uyarıcı elektrot imalatı kesme ~ 20 cm uzunluğunda platin-iridyum (200 mikron kaplanmış çapı 125 mm çıplak çapı) ile başlar. Daha sonra, yarım uzunluğu bükün ve tel ucuna düğüm ~ 2 cm bırakarak, gevşek bir kare düğüm içine gevşek uçları bağlamak.
        2. Bir masa üzerine yerleştirilen elektrikli el matkap mandreni düğüm sabitleyin.
        3. Bir hemostat ile telin diğer ucunu tutarken, tel sıkıca bükülmüş kadar kısa bir süre için (yani, her kesim yüzeyi tel çözülüyor olmadan ters yönde kesilir birbirinden eşit uzaklıkta olacaktır matkap açma ve kapatma .)
        4. Sonra, platin-iridyum bükülmüş teller çıplak uçlarını uyarıcı elektrot bir uyarıcıya izolatör bağlamak için kullanılan teller yol bağlı olması gerekir.
          1. Bu serbest uçları ~ 50 cm 30 gauge tel platin-iridyum tel lehim yapılır.
          2. Birincisi, bir masa üstü ve bükülmüş tel ucuna konsantre HCl bir su birikintisi bırak bant platin-iridyum bükülmüş tel.
            1. Sonra, her tel tel kesici kullanarak yaklaşık 1 cm yalıtım şeridi.
            2. , Bükülmüş tel sonuna bitişik bir kurşun tel elimden sonuna yerleştirin ve iki kabloyu sıkıca tutturulmuş kadar, sonra ince uçlu bir lehim demir lehim ısı uygulamayın.
          3. Maruz kalan tel bağlantısı üzerinden ısı shrink boru uzunluğu küçük bir kayma ve ısı ile uyum küçültmek.
          4. Ikinci tel için tekrarlayın.
          5. 15 cm Pasteur pipet ucu bükülmüş çıkıntı yaklaşık 6 cm kadar lehçe ve pipet aşağı bükülmüş platin-iridyum tel kılavuzu Yangın.
          6. Elektrot her iki ucunda sızdırmazlık için su geçirmez epoksi (örneğin, JB Weld) kullanın.
          7. Son olarak, muz fişler uyaran izolatör bağlantı için kurşun tel ucuna takın.
          8. Stereoskopik gözlem altında, PBS içinde elektrot ucu yerleştirin ve sadece elektrot uçları kesik ucuna gelen elektrolitik üretilen baloncuklar için bakın. Kabarcıkları bükülmüş teller taraftan gelirse, yeniden kurmak sağlam yalıtım tel uzun eksenleri taze bir tek kenar jilet kullanarak enine kesilmiş elektrot kesti.
          9. Anormal uyaran etkilerini gidermek için sorun giderirken, yeni kesilmiş bir elektrot ucu yapmayı deneyin.
    4. Kayıt yemekler olarak oluşurYaklaşık 1.0 cm arayla iki adet 1.0 x 12 mm cam çubuklar üzerinde oturuyor 35 mm kültür çanak biti kültür yerleştirin. Cam tüpler, ısıtma ve sonra forseps ile taban içine basarak çanak tabanı cam çubuk takın.
      1. Statik kayıt koşulları için 1.5 ml orta, çanak ekleyin.
      2. Sonra, orta 1,0 mL steril pamuk ~ 10 mm genişliğinde ve 3-4 cm uzunluğunda parça bekletin. Uzun ekseni boyunca yarısında pamuk katlayın ve iç kuyu boyunca steril forseps ile ekleme yerleştirin. Islak pamuk çanak nem korunmasına yardımcı olur.
      3. Tüp üç sıkıştırılabilir 4 mm uzunlukları eşit eklemek çevresinde aralıklı.
      4. Sıkı çanak gaz alışverişi sağlayan polivinil klorür film ile kaplayın.
      5. Aşırı polivinil klorür film kaldırmak için tek bir kenar jilet ile orta-dikey duvar etrafında kesin.
  3. Elektrofizyolojik kurulum
    1. Bir dilim kültür eklemek montaj PDMI elektrofizyolojik kayıtlar için kayıt odasına yerleştirilir.
      1. PDMI odasında ekleme / kültür çanak montaj gerektiği gibi kayıtları elektrotlar, orta girişi / çıkış tüpleri, vb için konumlandırılmış çeşitli küçük delikler, PDMI odası ile birlikte 2 mm kalınlığında plastik disk ile kaplıdır
      2. Biz, T termokupl prob 7.3 pH ve 36.0 ° C koşulları sağlamak için kapalı bir yarı-mikroelektrot içine monte edilmiş bir minyatür Tipi ile minyatür bir kombinasyonu pH elektrodu ve sıcaklık ile periyodik olarak orta pH izlemek.
      3. Ekleme / odası,% 5 karbondioksit dengesi hava ve orta ya statik veya 35-36 düzenlenen eklemek merkezi ile bir akış (1.2 ml / dakika) yapılandırma düzenlenen ° C ile gazlı
      4. Akış koşulları için 36, orta kayıt odasının ortasında tutmak için tekrar bir satır içi ısıtıcı ile ısıtılır ° C
        1. Bir basınç tahliye ile peristaltik pompa sistemi, pompa titreşimler olmadan dilim kültürleri içine orta getiriyor. PDMI odası ile birlikte bir aspiratör, nazik vakum yoluyla ekleme orta kaldırmak için kullanılır.
      5. Istikrar için, oda ters bir mikroskop tutar ve titreşimsiz bir masaya oturur, özel olarak tasarlanmış Burleigh-Cebelitarık inverted mikroskop sahne üzerine monte edilmiştir.
      6. Küçük, pille çalışan koter aracı ile polivinil klorür eklemek şal ile küçük delikler açılır.
      7. Sonra, bir akış konfigürasyonu kullanılacak ise, giriş ve çıkış akışı bir zemin elektrot yerleştirme başlanmıştır. Aksi takdirde, sadece toprak elektrot yerine koyun.
      8. Mikromanipülatörler ile yerine düzenlenen Elektrotlar, tam bir dilim 5x büyütme (Şekil 1) ters bir mikroskop ile görüntülendi yukarıda konumlandırılmış.
        1. Uyarıcı elektrot tarafından takip edilen kayıt elektrodu ile başlayın.
        2. Biz mikroelektrot dilim ile temas nota bir ses monitör kullanabilirsiniz. Ucu CA3 piramidal hücre gövdesi tabakası boyunca orta noktada konumlandırılmış.
        3. Kayıtlar başladı, ve sonra uyarıcı elektrot dentat girus ve orta yüzeyine hafifçe dokundu.
        4. Her iki durumda da, ilk elektrot hareketleri kaba kontrolleri ile gerçekleştirilir ve bu hücre gövdesi tabakaları kolayca ayırt edilebilir, böylece son konumlandırma sadece hidrolik, ince kontrolleri ile faz kontrast aydınlatma kullanımı.
        5. ~ 25 mikron aralıklarla direkt mikroskobik görselleştirme altında önceden elektrotlar.
        6. Elektrotlar, doku temas elektrotlar 20-30 mikron önceden.
        7. Kayıtlar uyarıcı elektrot yerine koymak bu SD tetiklemez emin olmak için önce (yani mekanik bir uyaran ile) başladı.
        8. ~ Deneyler başlamadan önce 10 dakika geçmesi için izin verilir.
  4. Transynaptically SD indüklenen.
    1. Optimize (Şekil 2) aşağıdaki gibi CA3 alanında uyarılmış potansiyeller.
      1. CA3 alanında potansiyel bir yanıt (örneğin, ~ 1-5 uA) tetiklemek için yeterli bir akım ile 100 s bakliyat (0.2 Hz) başlangıcı ile uyarılmış.
      2. Alanında potansiyeli maksimum kadar piramidal nöron uzun ekseni boyunca aralıklarla kayıt elektrodu taşıyın.
      3. Daha sonra, bu pozisyon kayıt elektrot ile mevcut artırmak ve maksimum akım yanıt (örneğin, ~ 10-20 uA) not edin.
      4. Son olarak, (örneğin, sahte kontrolü periyodik stimülasyonu), deneyler için maksimum yarım uyaran yoğunluğu kullanabilirsiniz.
    2. Synaptically uyarılmış SD (Şekil 2) için eşik belirleyin.
      1. Yapılandırılmış elektrotlar, uyarılmış alanında potansiyeller için yukarıda özetlenen, tek elle uyarılmış patlamaları uyarılması paradigma geçiş10 bakliyat (10 Hz @ 100 s / pulse), bir paradigma, önceden tüm hayvan çalışmalarında uygulanır.
      2. SD tetiklenen kadar aşamalı uyaran patlama başına akım yoğunluğu artar. Uyaranlar arasında en az 60-120 saniye bekleyin.
      3. Coulomb Rapor SD eşik (yani, x zaman).
    3. Yanıtlarını ölçmek çok sayıda pazarcı indüksiyon gerektiren diğer deneylerde, SD uyandırmak için muhtemel bir uyarıcı gücü kullanın (örneğin, ~ 100-500 nC).
      1. Tetik SD her bir saat 9 dk.
      2. Deneyler boyunca aseptik teknikler kullandığınızdan emin olun.
      3. Son SD sonra normal kuluçka koşulları, kültür eklemek dönün.
        1. SD deneyimli kültür nota kültür çanak işaretleyin.
        2. Bizim alışkanlığı, soldan sağa doğru # 1, # 2 ve # 3 olarak her üç kültür belirterek, sol ve iki dilim kültür eklemek sağ işaretleri tek bir işareti koyun.
        3. Kültür hasata kadar her 3-4 günde bir, orta değiştirin.
    4. Tekrarlayan SD için, yukarıda açıklanan prosedürleri takip edin.
    5. Genellikle SD eşiği 1, 3, 7, ve 14 gün çok sayıda pazarcı bir ilk bir saat sonra bir değişiklik için test edin.
    6. CA3 alanında hızlı ve yavaş potansiyel potansiyel değişiklikleri ayrı bir dijital sinyal işleme sistemleri aracılığı ile kaydedilir.

2. Hipokampal Dilim Kültürleri Örnek Vital Görüntüleme

  1. Ikamet eden bağışıklık hücrelerinin (yani, mikroglia) Dinamik fonksiyonel davranış hücre hasarı veya immün aktivasyon (Şekil 3) olmadan dilim kültürlerde benzer şekilde izlenecektir. 9
    1. Örneğin, SD sinaptik aktivite değişiklikleri ile ilgili hareketini değerlendirmek için mikroglia etiket, isolectin-IB 4 fluorofor etiketli kullanılır.
    2. Kalsiyum katyonları (0.1-1.0 mM) mikroglia hücre zarlarının α-D-galactosyl moieties lektin bağlamak için gerekli olduğundan "lektin PBS" ek katyonlar ile PBS (0.1 mM her CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2).
    3. "Lektin PBS" bir çözüm olun:
      1. 1 litre PBS için aseptik teknik ve steril filtrasyon kullanarak ekleyin:
      2. 1M MgCl 2 100 mcL
      3. 1M MnCl 2 100 mcL
      4. 1M CaCl 2 100 mcL
    4. ° C birleştirmek ve 4 buzdolabında tutmak iyice karıştırınız.
      1. "Lektin PBS" Sadece 500 mcL isolectin, flakon başına gereklidir, ama buzdolabında ve bir kerede ay boyunca tutulan bu yana, geniş hacimli telafi etmek için yararlı olabilir.
    5. Sulandırın AlexaFluor isolectin IB4 (isolectin) tozu "lektin PBS" 1'e mg / ml liyofilize 594 etiketli.
      1. Photobleaching en aza indirmek için, ışığa maruz kalma en aza indirerek, mümkün olduğunca çabuk bu adımı gerçekleştirmeniz.
      2. Isolectin 20 mcL aliquoted olabilir kez 1mg/ml sulandırılmış ve bir yıla kadar -20 ° C'de muhafaza.
      3. 20 mcg / ml normal inkübasyon koşullarında görüntüleme 4-10 saat önce büyüme, orta ve inkübe dilim kültürler isolectin sulandırınız.
    6. Görüntüleme ayarlayabilirsiniz.
      1. Mikroskop, panjur, kamera, ışık, 2.0 nötr yoğunluk filtresi, 36 ° C, gaz::% 5 CO2, hava (veya% 20 oksijen, azot dengesi) Görüntüleme set-up oluşur.
      2. Mikroskop, fotoğraf makinesi, UV ışığı, sıcaklık kontrolü, ve gazlar görüntüleme önce en az bir saat açın.
    7. MetaMorph Görüntüleme Protokolü ayarlayın.
      1. "Journal" 'dan aşağı açılır menüsünden, Dergi Çalıştır "ı seçin ...".
      2. Bu, "Hareket w-var afs (dergi, daha önce aşağıdaki adımları takip kurulacak)" seçmelisiniz DERGİLER klasörünün açılması istemi, "Aç" seçeneğini tıklatın.
      3. "Otofokus Frekans" penceresinde 1 sayısı tutmak kadar yanındaki açılır, "Tamam" a tıklayın.
      4. Ardından, Kur "Sıralı Dosya Na ..." penceresi, her şeyi olduğu gibi tutmak, açılır:
        1. Temel Adı: Resim;
        2. Görüntü sayısı: 1;
        3. Numara Genişlik: 3;
        4. Farklı Kaydet Türü: MetaMorph TIFF;
        5. görüntü zaten varsa, -> otomatik olarak Overwrite;
        6. "Dizin Seç ...", bu neden olacaktır" Klasöre Gözat "penceresi açılır için tıklayın. Burada, film karelerinin kaydedilmiş olmalıdır klasör (ya da yeni bir klasör oluşturun) seçeneğini seçin.
        7. Sonra, doğru klasöre (örneğin C: \ Data \ Yeni Klasör) alt kısmında görüntülenen "Kurulum Sıralı Dosya Na ..." penceresinde, "Tamam" a tıklayın.
        8. Acquire penceresinde:
          1. Ayar DiIMGBIN2 olmak için sol alt köşedeki seçin;
          2. "Poz zamanı: 20ms" binning ": 1.
        9. Sonra, Özel sekmesinde:
          1. "Sensör Modu:" MS;
          2. "Digitifazına eklendi ": 10MHz (EM Kazanç);
          3. Kazanç: Gain3 (3x);
          4. Açığa için açın; Berrak Modu:: Temiz ÖN EXP; Temizle Sayısı: 2, Tetik Modu ve Canlı Tetik Modu: Normal (ZAMAN) Kamera Shutter;: "45 EM Kazanç" seçin.
        10. "Ort için Çerçeveler": 3.
        11. "Kapat" düğmesine tıklayın..
    8. MetaMorph görüntüleme kurduktan sonra, iki alt 1 mm cam çubuklar ile 35mm kültür çanak eklemek.
      1. Sıra, daha eklemek stabilize için, ekleme ve kültür çanak duvarları arasına monte kauçuk boru üç 2 mm'lik parçalar.
      2. Nemlendirilmiş bir ortam sağlamak için eklemek içinde ek olarak 1 ml orta batırılmış pamuk ~ 10 mm genişliğinde bir parça yerleştirin. Duvarları ile aynı hizada ve hipokampal dilim uzak olduğundan emin olun.
      3. Sıvı kaybını önlemek için polivinil klorür film kültürü çanak üst sıkıca örtün.
    9. CA3 piramidal hücre katmanı görüntüleme odağı olduğundan emin olun. 5x, 10x ve 20x faz resimleri alarak dilim yönünü not edin.
    10. Ekranda beliren "Focus Bul" penceresinde, set Aralığı, güncel + / - (altındaki kutuları hem de kontrol edilmelidir) "1" olarak mikron (ler), "8", ve Doğruluk .
    11. Bir odak görüntü sağlamak için "Focus bul" tıklayın.
    12. "Timelapse Edinme" penceresinde, Zaman Aralığı "1 dakika" ve "6 saat" (Bu bizim tercih edilen satın alma parametreleri) Süre seçin.
      1. Mikrogliyal hareketleri doğru yakalamak için, görüntüleme, günde bir dakikadan daha az sıklıkta olmamalıdır.
    13. Görüntü Saklama, Stack seçin.
    14. Update Resim Pencereli kutu değil, diğer iki kutu altında kontrol edilmelidir.
    15. "Illum" "Lambda" olarak seçin.
    16. "Tamam" a tıklayın.
    17. Film şimdi çalışmaya başlayacak. Bu film daha sonra sonraki zaman satın alma aşamasında durur sonra Esc tıklayarak erken film durdurana kadar film bitene kadar ya da başka bir şey MetaMorph program dahilinde yapılabilir anlamına gelecektir.
    18. Filmin sonunda, (A) Yukarıda da belirtildiği gibi Sytox tarama ile hücre hasarı kontrol edin.

3. Düşük Seviyeli Sitokin Sinyal 11-15 RNA Ekstraksiyon

  1. Daha önce düşük düzeyde sitokin dilim kültürler qPCR ve PCR dizi teknikleri kullanarak sinyal tespiti için ayrıntılı talimatlar sundu. 6,7
  2. Biz belirgin yaklaşımlar duyarlılık dilim kültürlerde sitokin mRNA tespiti için geliştirilmiş ve bu gelişmeler hediyem var.
  3. Iyileştirmeler için, örneğin, algılama ~ 6 önceki tekniklere göre daha duyarlı süreleri ve izin tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) değişim ve cDNA preamplfication örneklerin prescreening doku hasat ve RNA izolasyonu için yaklaşım, kesit kültürü interferon-gamma (IFN-λ) ilk kez algılama 15
  4. PCR hazırlanması.
    1. Dilim kültür hasat.
      1. Aşağıdaki deneyleri, dilim kültür ekler ° C kadar 3 gün öncesine kadar daha fazla işlem, daha sonra 2-3 ml RNA batık ve 4 saklanır.
      2. Hasat için, (yani, hipokampus uygun herhangi bir komşu dokulara) bir elmas bıçak kullanılarak doku gereksiz çıkarın ve ince uçlu bir boya kullanarak tamponlu salin (PBS), 0.5 ml steril fosfat içeren bireysel RNaz / DNaz ücretsiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dilim kaldırın fırçalayın.
      3. Stereotipik bir moda Spin örnekleri (10.000 rpm x 1 dak) tüm dilimleri tüpler aynı tarafında uygun.
      4. 500 mcL TRIzol PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon örnek çıkarın.
      5. Mağaza numuneler -80 ° C veya RNA ekstraksiyonu kadar buz üzerinde tutun.
    2. Sadece kit kullanımı daha fazla RNA verimi (Şekil 4) RNeasy Micro kit sonuçları ile RNA ekstraksiyon usingTRIzol.
      1. TRIzol numunelerin çözülme ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      2. Sağlam doku görünür artık kadar 1 mL örnek çizim ve doku ayrıştırmaları pippetor ve / veya vorteks uçlu.
      3. 100 mcL RNaz bedava (RF) kloroform ve tüp karıştırmak için 2-3 kez ters.
      4. Her dakika vorteks, 3 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
      5. 15 dakika 13.000 rpm'de Santrifüj 4 ° C
      6. Supernatant temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Arayüz rahatsız etmemek için dikkatli olun.
      7. Oda sıcaklığına eşit hacmi RF% 70 moleküler biyoloji notu etanol (~ 300 mcL) ekleyin.
      8. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme hafifçe karıştırın.
      9. RNeasy Micro kiti talimatına göre aşağıdaki adımları ile devam edin:
        1. RNeasy mikro sütun 2mL collectio yerleştirilen bir örnek uygulan tüp.
        2. Flow-through atmak için 10.000 rpm hızında 15 saniye santrifüjleyin.
        3. 350 mcL tampon RW1 RNeasy sütun yıkayın.
        4. Flow-through atmak için 10.000 rpm hızında 15 saniye santrifüjleyin.
        5. 70 mcL tampon RDD 10 uL DNaz 1 stok solüsyonu ekleyin, hafifçe karıştırın.
        6. Doğrudan membran DNaz çözüm 80 mcL uygulayın ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
        7. 350 mcL tampon RW1 RNeasy sütun yıkayın.
        8. Flow-through ve tüp atmak için 10.000 rpm hızında, 15 saniye santrifüjleyin.
        9. 500 mcL tampon RPE RNeasy sütun ekleyin.
        10. Flow-through atmak için 10.000 rpm hızında 15 saniye santrifüjleyin.
        11. 500 mcL RF% 80 moleküler biyoloji notu etanol RNeasy sütun ekleyin.
        12. 2 dakika 10.000 rpm'de santrifüj, flow-through ve tüp atın.
        13. Yeni tüpler kapakları açık RNeasy sütun yerleştirin.
        14. 5 dakika boyunca tam hızda (yani, 14.000 rpm) santrifüjleyin.
        15. RF mikrosantrifüj tüp RNeasy sütun aktarın.
        16. 14 mcL RF su, membran doğrudan uygulayın.
          1. Zehir için 1 dakika 10.000 rpm'de santrifüjleyin.
          2. Mağaza örnekleri -80 ° veya sonraki adımlara devam C.
    3. RNA kantitasyonu.
      1. RF 1x Tris-EDTA RiboGreen 1:200 (TE) tampon sulandırınız.
      2. Maya tRNA RNA standart olarak kullanılmak üzere hazırlayın.
        1. Çalışma stok 100 mcg / mL -20 ° C'de saklanan
        2. 1 mcg / ml (990 mcL TE 10 mcL) seyreltilir.
        3. 40 ng / ml standartları aşağıdaki gibi oluşturun: 60 ng / mcL, 60 mcL tRNA ve 40 mcL TE eklemek için, 100 için mcL ng /, 100 mcL eklemek için 80 mcL ng / 80 mcL tRNA ve 20 mcL TE eklemek 20 ng / mcL 20 mcL tRNA ve 80 mcL TE eklemek ve 0 mcL ng / 100 mcL TE, 40 mcL tRNA ve 60 mcL TE ekleyin.
      3. Numunesinin:
        1. 99 mcL TE + 1 mcL örnek birleştirin.
        2. Nüsha halinde her bir numune çalıştırın.
      4. Bir çok kanallı pipet kullanarak başına seyreltilmiş RiboGreen 100 mcL ekleyin.
      5. Karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı.
      6. Bir plaka okuyucu floresan ölçün.
        1. Floresein (485 nm/535 nm, 0.1 sn) programı.
        2. Excel'e İhracat sonuçları.
    4. RNA konsantrasyonu belirleyin.
      1. Grafik emiciliği karşı RNA konsantrasyonu ve Excel en uygun bir lineer regresyon hattı oluşturmak.
      2. En uygun hat ile ilgili regresyon denklemi örnek RNA konsantrasyonları belirleyin.
    5. RNA kalitesini belirleyin.
      1. Ribozomal RNA bant bütünlüğünü agaroz jel (Şekil 4) ile ölçülür.
        1. (= 1 mg RNA ve verimi küçük beri) elde edilen her RNA örnek bir kısmını çalıştırmak için pratik olmasına rağmen, periyodik kanıtı olarak örnek bir örnek denatüre bir agaroz jel çalıştırmak için iyi bir fikir olduğunu, bu yöntem düzgün yapıldığında verim, yüksek kalite RNA (yani, herhangi bir bozulma olmadan).
        2. % 1 agaroz jel (100 ml hacmi) hazırlayın.
          1. MESAFEDE, tepsi ve RNaz jel tarak ayrıntılı döküm, elektroforez tankı temizleyin.
          2. 1 gr ultra saf agaroz bir balona tartılır.
          3. RNaz ücretsiz su ve 10x MOPS 10 ml 83 ml [3 - (N-morfolino) propan sülfonik asit] tampon ve mikrodalga agaroz çözülür ve çözüm (~ 3 dk) açıktır kadar.
            1. 10x MOPS tampon yapmak için
              1. 83.7 g MOPS, 13.6 g sodyum asetat, ve 3.7 g EDTA birleştirin.
              2. 800 mL RNaz ücretsiz su ekleyin, karıştırın çözmek için.
              3. PH 7.0 'a ayarlayın ve 1 L. dolgu
              4. Sterilize veya otoklavda Filtre.
              5. Oda sıcaklığında saklayınız, ışıktan korunmalıdır.
          4. Jel ile 55 soğumasını bekleyin ° C ve 7 ml% 37 formaldehit (kimyasal bir davlumbaz bu adımı yapılmalıdır) ekleyin.
          5. Jel tepsisi döküm içine dökün ve kaputun katılaşmaya jel izin.
        3. RNA örnekleri hazırlayın.
          1. RNA numune tamponu (500 mcL, taze).
            1. 50 mcL 10x MOPS, 250 mcL formamid, 90 mcL% 37 formaldehit, 108 mcL RF H ​​2 O ve 2 mcL etidyum bromür (stok çözelti 10 mg / ml) birleştirin.
          2. RNA 1-10 mikrogram için, üç kat seyreltme için örnek tampon kullanarak hacimli, çift ekleyin.
          3. Denatüre 95 ° C, daha sonra 5 dakika ve 5 dakika buz üzerinde soğutun.
          4. Spin briefly ve (arzu edilirse yükleme boya eklemek) bir RNA merdivenin yanında kuyu içine tam bir örnek yük.
        4. Electrophorese
          1. 1x MOPS tampon ile oda doldurun.
          2. Işaretleyicileri kadar 50-75 volt Electrophorese jel 2/3rd uzunluğu yaklaşık göç etmiştir.
        5. UV transilluminator'de jel gözünüzde canlandırın.
          1. 28S bandı 18S bantlı (Şekil 4) olarak iki kat daha yoğun olduğunu keskin 18S ve 28S ribozomal RNA (rRNA) bantlar var olduğundan emin olun ve.
          2. Bozulmuş RNA lekeli bir görünüm, bulanık bantlar olacak, ya da 2:1 oranında göstermezler.
    6. Genelde toplam RNA kalitesini değerlendirmek için optik yoğunluk kullanın.
      1. Nanodrop yoluyla gibi duyarlı değildir, UV spektrofotometresi RNA kalite kontrol, hızlı ve maliyet etkin bir araçtır.
      2. Optik yoğunluk (OD) 260/280 oranı 1.5-2.0 arasında arayın.
      3. RNA (TE tampon karşı su) yeniden süspanse olduğu çözüm OD oranı etkileyeceğini unutmayın.
  5. PCR faaliyetleri.
    1. Ön-PCR kurulumu
      1. Tasarım spesifik primerler
        1. NCBI Primerblast kullanarak http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. Hedef genin Refseq üyelik numarasını girin.
          2. 70 ila 200 bp PCR ürün boyutunu belirtin.
          3. Ileri ve geri primerler arasında en az 5 ° fark ile 55-72 ° Tm belirtin.
          4. Genomik arka plan azaltmak için "Primer ekson ekson kavşak yayılabilir olmalıdır" seçeneğini seçin.
          5. Özgüllüğü Rat Refseq RNA veritabanı astarlar ek hedefler görmezsek emin olmak için kontrol etkinleştirin.
          6. Aşağıdaki kriterlere uyan sonuç bir primer çifti seçin:
            1. Uzun 18-30 bazlar.
            2. Şablonu dışında daha az 2000 üsleri.
            3. % 40-60 guanin-sitozin içerik şablonu astar istikrarlı bağlama sağlamak için.
      2. Bir referans gen seçimi.
        1. Her referans gen deneysel kurmak için uygun olacaktır. Her zaman yeni bir paradigma kullanılır, referans istikrar kontrol edilmelidir. Tutarlılık, RT 2 Profiler PCR dizisinde dört referans genlerin birini kullanmak için seçti.
        2. Iyi bir referans gen aşağıdaki kriterlere uygun olmalıdır:
          1. Ifadesini deneysel paradigma değişmiş değildir.
          2. Bu hedef gen benzer seviyelerde ifade edilir.
        3. Uygun bir referans seçmek için:
          1. Sistem istikrarlı bir referans gen için muhtemel adayları belirlemek için literatür gözden geçirin. Iskemi çalışmaları istikrarlı olduğu gösterilmiştir, çünkü Örneğin, Rpl13a test edilmiştir. 11,12
          2. Tasarım primerler yukarıda tartışıldığı gibi (ya da ortak referans genler için RTPrimerDB gibi bir veritabanı zaten valide primerler bulmak http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. (Aşağıya bakın) hedef gen primerleri yanında primerler optimize edin.
          4. Aday referans grup içi varyans dayalı, her gen bir istikrar değerini hesaplar ve en düşük ifade ile gen (ler) seçer Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) gibi yazılımları kullanarak en istikrarlı olduğu belirleyin örnekleri üzerinde varyasyonu. Örneğin, Rpl13a için optimal bir referans gen SD (Şekil 4).
      3. Primerler optimize edin.
        1. QPCR tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için, astar, tekrarlanabilirlik, duyarlılık ve özgüllük belirli kriterleri yerine getirmek zorundasınız.
          1. Her yeni primer çifti için bu parametreleri test etmek en iyisidir.
          2. Tekrarlanabilirlik teknik çoğaltır çalıştırarak test edilir.
          3. Hassasiyet bir standart eğri ile art arda 4 kat dilüsyonları performansı ile tespit edilebilir.
          4. Özgüllük erime eğrisi analizi ve jel elektroforezi (Şekil 5) ile tek bir ürün teyit tarafından belirlenir.
        2. Primerlerin kalitesini test etmek için bir qPCR plaka ve konsantrasyon kullanılmak üzere astar çalıştırın.
          1. 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, hiçbir şablon kontrolü (NTC): tüm beyin RNA sentezlenen cDNA kullanarak, aşağıdaki gibi bir standart eğri (üst üste 4 kat dilüsyonları serisi) oluşturmak .
          2. Her seyreltme için, 1 mcL cDNA duplica içinde çalıştırmakprimerlerin her konsantrasyon, (yani, 100 Nm, 200 Nm, 300 nM) te.
        3. Teknik tutarlı Ct değerlerini vermek çoğaltır olduğu onaylayın.
        4. Seyreltme eğrisi için Ct değerlerini inceleyin.
          1. Dilüsyonları her biri için konsantrasyon karşı Ct değerlerini çizilir. Ortaya çıkan grafik iyi bir korelasyon katsayısı (yani,> 0.95) doğrusal olmalıdır.
        5. Tek bir amplifikasyon ürünü varlığını onaylamak için (yani, tek bir pik) eğrisi eritebilir inceleyin.
          1. Çoklu tepecikleri, ya da benzer zirveleri değilseniz, bu kirlenme, mispriming, primer-dimer artifakı, vb (Şekil 5) önerebiliriz.
          2. NTC tepe muhtemelen cDNA şablonu yokluğunda daha kolay formu astar dimerleri karşılık gelir ve bir endişe olmamalı.
        6. % 1 agaroz jel amplifiye ürünler çözmek erime eğrisi verileri onaylayın.
          1. % 1 agaroz jel hazırlayın (100 ml hacmi)
            1. 1 g agaroz, bir balona tartılır.
            2. 1x Tris-EDTA asetat (TAE) ve tampon ve mikrodalga agaroz çözülmüş ve çözüm açıktır kadar 100 mL ekleyin.
              1. 1 L 50x TAE tampon 2 M Tris baz, 57 ml buzul asetik asit ve 0.05 M EDTA (pH 8.0) oluşur.
              2. Distile su ile (40 mM Tris-asetat ve 1,0 mM EDTA son konsantrasyonları) 1x TAE tampon sulandırınız.
            3. Jel ile 55 ° C etidyum bromür 0.5 mg / ml 'lik bir konsantrasyon eklemeden önce soğumaya bırakın.
            4. Jel tepsisi döküm içine dökün ve oda sıcaklığında katılaşmaya izin.
          2. Çalıştırmak için, 1x TAE dolu elektroforez odasında jel yerleştirin, 2 mcL 6x yükleme boya ile qPCR plaka 10 mcL örnek kombine ederek iyice karıştırın ve bir molekül ağırlığı merdiven yanında kuyu içine yüklemek.
          3. Işaretleri cDNA ürünün beklenen boyutuna bağlı olarak, uygun bir mesafe göç etmiş kadar 50-150 volt Electrophorese.
          4. UV transilluminator'de ile gözünüzde canlandırın.
          5. Amplifiye PCR ürünü hedef için uygun büyüklükte olduğundan emin olun.
          6. Primer dimerleri 50 bp civarında olacak.
    2. Için ön ekran TNF-a yükselmiştir.
      1. TNF-α çevre inflamasyon reaksiyonları başlatan bu yana, biz bu beyin için de doğrudur ve devam etmeden önce dilim kültürü bağışıklık durumu (yani, normal, plasebo ve deney grupları) bir belirteç olarak TNF-α mRNA için ilk eleme kullanabilirsiniz şüphelinin tam PCR dizi analizleri.
      2. Normal ve sahte kontrolü TNF-α mRNA düzeyleri değilseniz, laboratuvar, deney (yani, normal, plasebo ve deney grubu) içinde bulunan bir interassay aralığında atılır ve tam PCR dizi analizleri devam etmeyin.
      3. iScript cDNA sentezi.
        1. 4 mcL 5x reaksiyon karışımı 20 mcL nihai hacmi, 1 mcL ters transkriptaz, 25 ng RNA, ve RF H ​​2 O her RNA örnek için, PCR tüpü aşağıdaki birleştirmek.
        2. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
        3. Inkübe: 25 ° C, 5 dk, 42 ​​° C, 30 dakika 85 ° C, 5 dk.
        4. 01:04 (60 mcL RNaz ücretsiz su ekleyin) seyreltilir.
        5. -20 ° C'de saklayın ya da birkaç saat içinde kullanıma hazır oluncaya kadar buz üzerinde tutmak.
      4. TNF-α için qPCR.
        1. Her bir primer çifti için bir master karışımı hazırlayın.
          1. 12.5 mcL iQ SYBR yeşil, örnek başına 1 mcL astar karışımı ve 10.5 mcL su birleştirin.
          2. Rpl13a ve TNF-α primerleri için, 200 nM optimum konsantrasyonu.
          3. Astar ve gerektiğinde waster hacmi 1,5 mL RF mikrosantrifüj tüp miktarını ayarlayın ve buz üzerinde tutmak plaka kurdu.
        2. Kontrolleri / Shams / experimentals qPCR plaka ayarlayın. Her bir gen için yinelenen cDNA örnek başına 1 mcL kullanın.
        3. Her bir kuyunun 24 mcL ana karışımı ekleyin ve karıştırın ve aşağı yukarı pipetle.
        4. Floresan okuma engel olacak şekilde, kabarcıkları önlemek için çok dikkatli olun.
        5. 40 döngü PCR çalıştırın:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 döngü: 95 ° C, 10 saniye, 60 ° C, 30 saniye, 72 ° C, 20 sn / çevrim.
          3. Eritin eğrisi her 55 itibaren 10 saniye için 0.5 ° C lik artışlarla 80 döngüleri ° C - 55 ° C, 1 dak:
      5. (ΔΔCt yöntemi; Şekil 4) veri analiz edin. 13
  6. PCR diziler için cDNA sentezi.
    1. RNA 250 ng her numunenin hacmi (mcL) hesaplayın.
      1. Tutarlı örneklerinden elde edebilirsiniz RNA (100 ng 1 mikrogram) bir miktar seçin.
    2. RT 2 Birinci Strand Kit - üreticinin talimatlarına göre. Kısaca:
      1. Çözülme ve tüm reaktifler aşağı döndürün.
      2. Her RNA örnek için, PCR tüpü aşağıdaki birleştirmek:
        1. RNA 250 ng, 5x genomik DNA (gDNA) ortadan kaldırılması tampon ve su son hacim 10 mcL 2 mcL.
      3. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
      4. 42 ° C'de 5 dakika inkübe.
      5. 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutun.
      6. Bu arada, ters transkripsiyon (RT) kokteyl (örnek başına) hazırlayın:
        1. 5x RT tampon 3, 1 mcL astar ve harici kontrol karışımı, 1 mcL RT enzim karışımı 3 ve 3 su mcL 4 mcL birleştirin.
      7. Her bir örnek RT kokteyli 10 mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın.
      8. 42 ° C'de 15 dakika inkübe.
      9. 95 ° C 'de 5 dakika inkübe tarafından tepki durdurun.
      10. Her 20 mcL cDNA sentezi reaksiyonu (111 mcL son hacim seyreltik) RF H ​​2 O 91 mcL ekleyin.
      11. Pipetleme ile iyice karıştırın.
      12. -20 ° C'de saklayın ya da birkaç saat içinde kullanıma hazır oluncaya kadar buz üzerinde tutmak.
  7. RT 2 Profiler PCR dizi.
    1. Aşağıdaki talimatlar, üretici takip ve rahatlık için burada yineledi.
    2. Reaktifler hazırlayın
      1. Çözülme ve tüm reaktifler aşağı döndürün.
      2. Deneysel kokteyl hazırlayın:
        1. 1350 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, seyreltilmiş cDNA 102 mcL ve RF H ​​2 O 1248 2700 mcL nihai hacmi mcL mcL birleştirin.
      3. Poşet PCR dizi dikkatlice çıkarın.
      4. Kokteyl yükleme haznesine koyun.
      5. Çok kanallı pipet ile her bir kuyunun 25 mcL ekleyin.
      6. Dikkatle mühür PCR dizi plakası.
      7. Oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 rpm'de plaka santrifüjleyin.
      8. PCR programı kadar buz koyun hazırdır.
    3. Makineniz için en uygun bisiklet programını çalıştırın.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 dk.
        2. 40 döngü: 95 ° C, 15 saniye, 60 ° C, 1 dak.
        3. Eğrisi eritin: 55 ° C, 1 dakika 10 saniye, her 55 ° C için 0.5 ° C lik artışlarla 80 kür
    4. Verileri analiz ediyoruz.
      1. Bazal döngüleri için "Otomatik Hesaplanan" seçin.
      2. Eşik değeri, elle ayarlamak için eşik pozisyon için "Kullanıcı Tanımlı" seçin.
        1. "Log Görünüm", amplifikasyon arsa doğrusal faz alt üçte birinin eşik ayarlayabilirsiniz.
        2. Eşik değeri çalışır boyunca aynı tutmak için emin olun.
      3. Veri Aktarma.
      4. Bir Excel dosyasına girdi.
      5. SABiosciences PCR Dizi Veri Analizi için yükleyin.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. Referans genler seçin biz Rpl13a kullanılır.
      6. Bizim uygulamaya:
        1. Sonuçları en az bir yinelenen PCR dizisi ile onaylayın.
        2. 3-kat bir dizi değişiklikler sonraki belirli bir hedef PCR ile teyit edilmesi gerekir. 6,7
        3. 2x Değişiklikleri onaylamak için daha az 3 kat değişiklikler sonraki belirli bir hedef 2-3 PCR dizileri (PCR veya kullanımı ile teyit edilmelidir.
    5. DNA amplifikasyon öncesi beklenen ultra-düşük bir ifade (Şekil 6) ile hedeflerini analiz etmek için kullanılır .
      1. SABiosciences Kullanıcı RT 2 Nano PREAMP cDNA sentezi kiti ve astar karışımları tam bir PCR dizi çalıştırmak için küçük miktarlarda numune RNA (1-100 ng) izin RNA preamplifikatörde için tasarlanmıştır.
      2. Her astar karışımı, en az önyargıyla 89 gen-spesifik cDNA hedef şablonları amplifikasyon sağlar. IFN-λ gibi düşük seviye sinyalleri detectible bir seviyeye yükseltme için bir araç olarak bu sistemi kullandık.
      3. RT 2 Nano PREAMP cDNA sentezi kiti üreticinin talimatlarına göre. Kısaca:
        1. Çözülme ve tüm reaktifler aşağı döndürün.
        2. Her RNA örnek için, PCR tüpü aşağıdaki birleştirir.
          1. 1-RNA 100ng, 10 mcL nihai hacmi 5x gDNA eleme tampon ve su 2 mcL.
        3. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
        4. 42 ° C'de 5 dakika inkübe.
        5. 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Bu arada, (örnek başına) RT kokteyli hazırlamak.
          1. 5x RT tampon 3 4 mcL, 1 mcL astar ve dış kontrol karışımı, 1 mcL cDNA enzim sentezini karışımı, 1 mcL RNaz inhibitörü, su ve 3 mcL birleştirin.
        6. Her bir örnek RT kokteyli 10 mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın.
        7. 42 ° C'de 15 dakika inkübe.
        8. 95 ° C 'de 5 dakika inkübe tarafından tepki durdurun.
        9. -20 ° C'de saklayın veya kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutmak.
      4. spesifik primerler ile cDNA.
        1. PCR tüpü aşağıdaki karıştırın:
          1. 12.5 mcL PCR master miks, 7.5 mcL spesifik primerler ve sulandırılmamış cDNA 5 mcL.
        2. 12 PCR döngüsü çalıştırın.
          1. 95 ° C, 10 dk.
          2. 12 kür: 95 ° C, 15 saniye, 60 ° C, 2 dk.
          3. 4 tutun ° C.
        3. Her bir numune için 2 mcL yan reaksiyon azaltıcı ekleyin.
        4. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
        5. 95 ° C 'de 5 dakika inkübe tarafından tepki durdurun.
        6. Her 27 mcL cDNA reaksiyonu 84 mcL RF su ekleyin.
      5. -20 ° C'de saklayın ya da birkaç saat içinde kullanıma hazır oluncaya kadar buz üzerinde tutmak.
      6. SAB astar ve yukarıda açıklandığı gibi SYBR yeşil master miks kullanarak bireysel gen hedefleri artırın.

4. Sitokin Sinyalleşme Multiplexed Phosphoprotein Tahliller

  1. Mutliplexed phosphoprotein deneyleri sitokin ligand-reseptör downstream sinyalizasyon (Şekil 7) tanımlamak için kullanılır.
  2. Dilim kültürlerde toplam protein miktarını belirlemek.
    1. 1 ml soğuk yavaşça dilim ekler ve yer kaldırma Hasat dilim kültürleri (4 ° C) PBS.
    2. 30 sn ve kaldır PBS için borular santrifüjleyin. Kuru buz koyun hasadı tamamlanana kadar.
    3. -80 ° C saklayınız
  3. Dilim toplam protein tayini için kültürleri homojenize edilir.
    1. Üreticinin talimatlarına göre hücre lizis tamponu hazırlayın.
      1. Tampon toplam hacmi proteaz inhibitörleri her dilim kültürü en az 200 mcL lizis tampon yerleştirmek için gerekli.
        1. Örneğin: 20 Faktör 1, Faktör 2 ve DMSO 500 mM PMSF 20 mcL 4,95 ml hücre lizis tamponu 10 mcL mcL ekleyin.
    2. Buz üzerinde 200 mcL lizis tamponu dilim kültürler çözülme.
    3. 1 sn bakliyat dilim kültürler beş kez sonikasyon ve buz üzerinde hemen geri yerleştirin.
    4. 10 sn Vortex örnekleri.
    5. 4 numune Santrifüj ° C 13.000 rpm'de 15 dk.
    6. Temiz bir tüpe supernatant aktarın ve buz üzerinde tutmak.
  4. Total protein tahlil gerçekleştirin.
    1. Protein standartları hazırlayın.
      1. Sulandırın stok sığır (BSA), üreticinin talimatlarına göre serum albümini.
      2. 0-1000 mg / ml BCA protein tayini için yüksek saflıkta su ile seyreltilmiş değişen standartlar hazırlayın.
    2. Çalışma reaktifi hesaplayın hacmi numune sayısı dayalı ve çoğaltır gerekli.
      1. Örneğin: (8 standartlarına + 18 bilinmeyen örnekleri) x (2 örnek başına çoğaltır) x (kuyu başına 0,2 ml Gerekli çalışma reaktif) mikroplak yüklenen tüm örnekler için gerekli = 10.4 mL toplam hacmi.
        1. Yeterli hacim sağlamak için 12 ml toplam hacmi kadar yuvarlak.
      2. Karıştırma Reaktif çalışma reaktif Reaktif B, bazı bulanıklık meydana gelebilir, ama kısa zamanda kaybolur.
    3. Örnekleri ve iyi standartlarda 10 mcL yükleyin.
    4. Kuyulara 0.2 mL çalışma reaktifi yükleyin.
    5. Sızdırmazlık bandı ile plaka Kapak ve 30 sn karıştırmak için sallayın.
    6. 30 dakika için 37 ° C plaka inkübe edin.
      1. 595 nm dalga boyunda bir plaka okuyucu okumadan önce oda sıcaklığında (yaklaşık 10 dk) Cool plakası.
    7. Beklenen konsantrasyon vs ölçülen absorbans ile Microsoft Excel kullanarak, standart bir eğri oluşturun.
      1. Iyi bir korelasyon katsayısı 0.98 veya daha fazla eşit.
    8. Standart eğri elde edilen lineer denklem kullanarak örneklerinde protein konsantrasyonları hesaplayın.
    9. Lizis tamponu eşit miktarda protein ve mağaza -80 ° C daha fazla işlem için hazır olana kadar numune sulandırınız.
    10. Protein konsantrasyonu 200-900 mg / ml, üreticinin talimatlarına göre aralık olmalıdır.
  5. Multiplex Testi gerçekleştirin.
    1. Not: çoğullanır phosphoprotein bir gecede incu ardından 1 saatlik ilk set-up ve plaka yükleme deneyleri tamamlamak için toplam 2 gün sürebilirbation adım ve ertesi gün ilave inkübasyon ve yıkama adımları.
    2. Harita kuyu lizat kılavuzda çalışma sayfasına göre hangi içerecektir.
    3. Oda sıcaklığında, homojenize edilmiş doku örnekleri ve kiti lizatları çözülme ve ardından buz üzerine yerleştirin. Tüm tamponları ve reaktifler oda sıcaklığına (streptavidin ve boncuklar hariç) kitinde getirin.
    4. Multipleks testi için boncuk hazırlayın.
      1. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile birleştiğinde boncuklar içeren Kapak tüpleri. 5 sn ve buz üzerinde tutmak için Vorteks tüpleri.
      2. Birleştiğinde boncuk yıkama tamponu ile 1:50 seyreltilir.
        1. Her yanı sıra ortalama 50 mcL toplam hacmi 49 mcL yıkama tamponu birleştiğinde boncuk 1 mcL içermelidir.
    5. Vakum cihazı kalibre edin.
      1. Plaka başına 100 mcL yıkama tamponu ile yıkayın.
      2. 2-5 saniye içinde herhangi bir aşırı sıvı kapalı vakum ve emme açın.
        1. Tampon tümüyle kaldırılmasını uzun veya 2-5 saniye daha kısa sürerse, buna göre basınç valfi ayarlayın.
        2. Plakanın altındaki numune eklemeden önce iyice kurulayın.
    6. 5 saniye vorteksleyin seyreltilmiş birleştiğinde boncuk ve belirlenen kuyuların 50 mcL ekleyin.
      1. Hemen bir kağıt havlu ile vakum filtresi ve kuru plakanın alt.
    7. Plaka başına 100 mcL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra Plakanın alt kurulayın.
    8. Vortex 3 sn için örnekler çözülmüş ve belirlenen kuyuların 50 mcL ekleyin. Place ışıktan koruyarak, oda sıcaklığında 300 rpm çalkalama 15-18 saat, plaka ve inkübe üzerinde bant mühürleme.
    9. 100 mcL yıkama tamponu ile vakum filtre aşırı sıvı ve yıkama plakası üç kez. Her yıkamadan sonra Plakanın alt kurulayın.
    10. Yıkama tamponu algılama antikor 01:25 sulandırınız.
      1. Her iyi 25 mcL yıkama tamponu toplam hacmi 1 mcL algılama antikor gerektirir.
    11. Sızdırmazlık bantı plaka üzerine yerleştirin ve alüminyum folyo ile ışıktan korumak. Kademeli olarak 1100 rpm hızını artırarak, 30 saniye boyunca iyice çalkalayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için 300 rpm'de sarsmaya devam ediyor.
    12. Vakum plaka filtre ve 100 mcL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra Plakanın alt kurulayın.
    13. Plaka ışık korurken, ortalama 50 mcL eklemek için yeterli hacmi ile streptavidin-PE 1:100 dilüsyon hazırlar. Çözüm ışıktan koruyun.
    14. Iyice vorteksleyin ve başına 50 mcL seyreltilmiş streptavidin-PE ekleyin. 1100 rpm'de 30 sallayarak inkübe sn 300 rpm'de 10 dakika izledi.
      1. Vakum filtre aşan tampon kapalı.
      2. Ortalama 100 mcL tabanda tampon plaka üç kez yıkayın.
      3. Her yıkamadan sonra Plakanın alt iyice kurulayın.
    15. Her bir kuyunun 125 mcL tabanda tampon ve 1100 devirde 30 saniye çalkalanır.
    16. 24 saate kadar 4 ° C ışıktan uzak levha veya mağaza hemen okuyun.

5. Sitokin Sinyalleşme Taklit ve Modülasyon

  1. Rekombinant sitokin proteinleri (taşıyıcı), SD değişiklikleri taklit etmek için kullanılır.
    1. Liyofilize proteinler (örneğin, TNF-α) -20 ° C'de 1 yıl kadar saklanır
    2. 3 ay içinde kullanıma kadar bir stok solüsyonu% 0.1 sığır serum albumin, alikot ile seyreltilmesi sonra hazırlanır, -20 ° C'de saklanan.
    3. Herhangi bir manipülasyonlar dilim kültürleri, en azından her üçüncü gün yenilenir.
  2. Sitokin sinyalizasyon tarafından susturuldu:
    1. Geleneksel sitokin sinyalizasyon kaskad farmakolojik ajanların kullanımı;
    2. Çözünür ligand antagonisti kullanımı [örneğin, çözünür TNF reseptörü 1 (rekombinant ligandlar için yukarıda açıklandığı gibi)]; veya
    3. Gene susturulması [yani, küçük müdahale RNA (siRNA)].
  3. Nöronal hücrelerin siRNA teslimi genellikle sorunludur.
    1. Ortak lipid tabanlı reaktifler genellikle, düşük transfeksiyon verimlilik ve hücre canlılığı kaybı ile sonuçlanabilir.
    2. Bunun yerine, bir transfeksiyon reaktif kullanılmadan, yüksek verimlilik demonte için izin Thermo Scientific Dharmacon Accell siRNA'lar, kullanın.
    3. Burada dilim kültürlerde bu yöntemin kullanımı teyidi olarak Siklofilin B, tüm hücre tipleri ifade elzem olmayan bir protein, demonte göstermektedir.
    4. Teslimat protokol yapışık hücrelere kullanmak için üreticinin talimatlarına dilim kültürlere adapte edildi.
      1. 1x 5x siRNA tampon RNaz ücretsiz su ile seyreltilir.
      2. 1x tampon bir 100μM siRNA çözüm hazırlayın
        1. Siklofilin B siRNA 5 nmol sağlanmaktadır. 100 mcM hisse senedi için 50 mcL 1x tampon süspanse edin.
      3. Accell teslimat Mediu ile karıştırın siRNA1 mikrona kadar siRNA nihai konsantrasyonu m.
        1. 6 plaka Accell dağıtım aracı 1100 mcL mcM 100 stok siRNA 11 mcL ekleyin.
        2. Inkübatör yerleştirin ve sıcaklığı en az 20 dakika için normal inkübasyon koşullarının gelmesini sağlar.
      4. BSL-2 başlık ve steril tekniği, transfer ekleri teslim karışımını içeren kuyuların kullanma.
        1. Protein demonte için 96 saat boyunca teslim karışımı ile inkübe edin.
          1. Western Blot protein demonte değerlendirin veya immün yoğunlaştı.
          2. Demonte verimliliği için potansiyel bir ilk tercihi ise Western blot, SD zarar verici olmayan bir fenomen ile ilişkili düşük seviyeli bağışıklık sinyal için çok duyarsız olabilir.
          3. Buna göre, gümüş gelişmiş diaminobenzidin (DAB), immün ve bilgisayar tabanlı dansitometri ölçümleri (aşağıya bakınız) ile negatif Western Blot ölçümleri takip etti.

6. Proteomik Teyitleri

  1. Phosphoprotein değişiklikler hücre özgüllüğü immün kullanılarak kurulmuştur. 6,7
    1. Dilim oluşan PLP fiksatif ile 24 saat boyunca kültürlerin Fix:
      1. 10 ml% 16 paraformaldehid, 1.096 g lizin, 0.42 g sodyum fosfat, 0.17 g sodyum periyodat, toplam hacim 80 ml saf su (fiksatif pH 6.2) ile doldurulur.
      2. 24 saat sonra, yavaşça bölümüne hazır olana kadar ince bir fırça ve PBS içeren sodyum azid (100 mg / L) transfer ekler dilim kültürler kaldırmak.
      3. Sonra, dilim PBS-20% sakaroz en az 24 saat inkübe 20 mikron bölümleri, tüm dilim kültürler kesmek ve jel kaplı slaytlar montaj.
      4. Floresan immün (örneğin, NFκB) ~ 50 rpm sallayarak birleştiğinde tüm adımları aşağıdaki gibi gerçekleştirilir.
        1. 10 dakika süreyle 3 mL PBS üç kez dilim kültürler yıkayın.
          1. Ile yer slaytları Coplin kavanoz ~ 40 ml PBS ile yıkama adımlar için 20 mm dilim kültürler monte edilebilir.
        2. Dilim kültürleri PBS üç kez, yıkama başına 10 dakika yıkayın.
        3. SFX sinyal arttırıcı birkaç damla dilim kültürleri üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca nemli odasına inkübe edin.
        4. 2 saat için 37 ° dilim kültürler inkübe ° C% 0.75 seyreltilmiş 1:100 tavşan anti-NFκβ antikor PBS içinde Triton X-100.
          1. Pipet doğrudan dilimleri üzerine antikor çözüm.
        5. Antikor çözüm dilim çıkarın ve yıkama başına 10 dakika PBS içinde üç kez yıkayın.
        6. PBS içinde Triton X-100 0.75% dilim keçi anti-tavşan AlexaFluor 594 antikor 01:50 az bir saat oda sıcaklığında inkübe edin.
          1. Çözüm oluşan olabilecek herhangi bir çökelti kaldırmak için 10.000 rpm hızında 15 dakika için 594 AlexaFluor antikor santrifüjleyin.
        7. PBS, Yıkama başına 10 dakika içinde üç kez yıkayın.
        8. Distile suya batırın slaytlar PBS herhangi bir tuzları durulayın.
        9. Ile lamel antifade orta uzatmak ve ışıktan uzak kapalı, en az 2 saat süreyle kurumaya bırakın.
        10. Geleneksel veya konfokal (Şekil 7) floresan mikroskobu ile gözünüzde canlandırın.
  2. SiRNA demonte Protein üretim değişikliklerine hassas gümüş yoğunlaşması 16 ve sonraki dansitometrik kantifikasyon (örneğin, Siklofilin B için burada görüldüğü gibi) (Video Şekil 2) ile 7 immün geleneksel DAB artırılması tarafından değerlendirilecektir.
    1. Siklofilin B immün kullanarak parlak bir alan görüntüleme 7, son zamanlarda detaylı için standart prosedürler aşağıdaki gibidir:
      1. 24 saat boyunca anti-fare Siklofilin B (1:100) 4 ° C;
      2. Horseradish peroksidaz ikincil antikor etiketleme (1:100) izledi;
      3. Ve DAB görselleştirme.
    2. DAB dijital dansitometrik quantification17 izin vermek için reaksiyonlar çok silik f, Quinn ve Graybiel göre farklılaştırılmış bir gümüş prosedüre yoğunlaştırılmalıdır. 16
      1. Slaytlar rehidrate ve sonra iyice x 3, yüksek saflıkta su ile 10 dakika boyunca yıkayın.
      2. Coplin kavanoz ve 56 ° C'ye kadar sıcak, yüksek saflıkta su koyun slaytlar
      3. Amonyak gümüş nitrat çözeltisi (% 0.5) hazırlayın:
        1. Stok amonyum klorür (% 25-30), taze yüksek saflıkta su ile seyreltilir (1:1).
        2. Amonyum hidroksit (~ 100 ml başına 500-600 mcL) kısaca bulutlu ve açık sonra dönecek% 0.5 'lik gümüş nitrat çözümü karıştırarak damla damla ekleyin.
        3. 56 çözüm Sıcak ° C
        4. 10-12 dakika için bölümler inkübe edin.
      4. Yüksek saflıkta su (Bu ve sonraki tüm adımları Coplin kavanoz kullanarak oda sıcaklığında yapılır), 15 saniye slaytlar yıkayınız.
      5. Dip% 1 sodyum tiyosülfat (pentahidrat) 15 saniye boyunca kayar.
      6. Dip yüksek saflıkta su ile 15 saniye boyunca slaytlar.
      7. 2 dakika süreyle% 0.2 'altın klorür Ton slaytlar.
      8. 15 saniye için yüksek saflıkta su kaydırağı batırın.
      9. 2 dakika süreyle% 0.5 'lik okzalik asit slaytlar Açığa.
      10. 15 saniye için yüksek saflıkta su kaydırağı batırın.
      11. 5 dakika süreyle% 5 sodyum tiyosülfat slaytlar davranın.
      12. Yüksek saflıkta su, dihidrat ve kapak iyice yıkayın slaytlar.
      13. Slaytlar dansitometrik ölçümü için hazırız. 17
        1. , Parlak bir alan aydınlatma da dahil olmak üzere tüm ekipman, görüntüleme önce en az 20 dakika süreyle açık.
        2. Tüm dilim kültür bölümleri ters bir mikroskop 5-10x imaged.
        3. Işık yoğunluğu düzgün bir seviyede (örneğin, ~ 2,6 V) ve tüm görüntü satın almalar boyunca değişmedi.
          1. Nötr yoğunluk filtreleri, "0" tamamen siyah ve 4095 tamamen beyaz bir 12-bit ölçekli (0-4095) ~ 1500 ışık şiddeti bulaşan tam görüntü azaltmak için gerekli kullanılır.
        4. Dijital görüntüler daha sonra satın aldı ve dilim kültür bölümleri olmadan slayt bir alan teşkil edilen bir arka plan görüntüsü de dahil olmak üzere, (yani, sahte kontrol ve deney numunelerinin) elektronik olarak saklanan.
        5. Arka plan görüntüsü, tüm görüntüleri (sahte ve deneysel) ve her dilim kültür etrafında çizilmiş ve ışık yoğunluğu kayıtlı bulaşan bir ilgi alanı (AOI) çıkarılır.
        6. Görüntü yoğunluğu aralığı tüm deneyler için sabit bir aralığı ayarlanır.
        7. Anlaşılır olması için, sonuçta kontrol düzeyleri (Şekil 8) ile karşılaştırıldığında göreceli bir yoğunluk olarak ifade etti.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1
Şekil 1. Dilim kültür elektrofizyolojik kayıt paradigma Kayıt mikroelektrot ilk CA3 piramidal nöron katmana yerleştirilir ve daha sonra iki kutuplu bir uyarıcı elektrot dentat girus (DG) yerleştirilir.

Şekil 2
Şekil 2. CA3 alanında uyarılmış potansiyeller ve synaptically depresyon yayılmasını indüklenen. (A) Deneyler standart CA3 bölge alanında potansiyel yanıtları ve daha sonra yarı-maksimum yoğunluk CA3 alanında uyarılmış alanında potansiyellerini ortaya çıkarmak için kullanılan en üst düzeye çıkarmak için gerekli olan akım belirlenmesi ile başlar. Bu hazırlıklar arasında, uyarılmış sinaptik yanıtların normale belgeler. Bir dilim Kullanıcı alanında eksitatör yazılan sinaptik potansiyellerin en az 3 mV değil. Varsa, dilimleri atılır.. Yayılan depresyonun tetikleme için (B) İleri, trans-synaptically uyarılmış eşik aynı zaman saha potansiyelleri ise (sol sağ, yavaş tepkiler belirlenir. , hızlı karşılıklar) hazırlıkları 10 Hz stimülasyon (örneğin, hızlı potansiyel kayıtları dikey sapmalar genlikleri benzer) takip etmek kadar sağlıklı olduğunu belgelemek için kullanılır.

Şekil 3
Şekil 3. Sinaptik aktivite azalır. Kanıtlar ile ilişkili mikrogliyal hareket mikroglia dallanıp budaklanır ve artan sinaptik aktivite ile geri çekmek olduğunu gösterir, ancak sinaptik aktivite yanıt bu hücrelerin uzun mesafe hareket, yaralanmamış bir şekilde beyin tarif edilmemiştir . Bu hücrelerin bir kısmı, normal şartlar altında uzun mesafelere taşımak mikroglia show floresan isolectin B4 etiketleme ile sonuçlanır. Eşlik eden resimde gösterildiği gibi sinaptik aktivite tetrodotoxin kültür maruz kaldırılmıştır Ayrıca, bu seyahat mikroglia sayısı önemli ölçüde artmıştır. Kırmızı çizgiler işareti yollar birkaç örnek mikroglia kökeni işaret mavi oklar ile 6 saat arasında bir süre içinde mikroglia gitti. Kalibrasyon bar, 50 mm.

Şekil 4
Şekil 4. PZR tarama faaliyetleri. Qiagen kitleri tek başına kullanımından daha hipokampal dilim kültürlerden gelen RNA verimi (B), (A) bizim ellerimizle, bu sonuçlar anlamlı olarak daha fazla (t-testi P <0.001), çünkü RNA izolasyonu için Qiagen kitleri ile birlikte TRIzol kullanın Buna ek olarak, periyodik olarak RNA ekstraksiyon işlemleri keskin RNA bantları gösteren bir jel yardımıyla belirlenir yüksek kalitesi bozulmadan RNA üretmek onaylayın. (C) iyi bir denge değerine sahip bir referans gen seçmek için NormFinder yazılımı kullanın. Örneğin, dilim kültürleri maruzüç referans genler (Rpl13a, β-aktin, 18s) lipopolyssacharide (2 saat için 100 ng / ml) incelendi. Ct değerlerini bir istikrar değerini hesaplamak için kullanılır. Burada verileri [yayılan depresyon (veriler gösterilmemiştir) kullanarak diğer deneyler için] Rpl13a optimum bir referans gen olduğunu göstermektedir. (D), deneysel gruplar ve sahte kontrolleri arasında değişim kat RNA farklılıkları tespit etmek için hassas ve tekrarlanabilir bir aracı olarak "ΔΔCt" yöntemi kullanır.

Şekil 5
Şekil 5. PCR reaksiyonu kontrol eder. (A) PCR reaksiyonlarının kalitesini doğrulamak için bir araç olarak astarlar için seyreltme eğrisi ilâvelerle ölçmek. Örneğin, en uygun ilâvelerle Ct eşikler düzgün bir (1-5) bir artış göstermektedir. (B) Buna karşılık, ilâvelerle kötü primerler (1-5) ile aynı değildir (C) ek olarak, bir erime eğrisi gerçekleştirmek Sonuç istenilen amplikonlarının kirlenmesine neden olan DNA ve misannealed PCR ürünü (birden fazla tepe eğrileri olarak görünecektir), astar dimerleri dahil olmak üzere herhangi bir çift iplikli DNA yokluğunda gösterir, (yani, tek bir pik eğrisi) tespit olduğunu onaylamak için PCR testi.

Şekil 6
Şekil 6. Nano öncesi amplifikasyon hipokampal dilim kültürleri IFN-λ algılanmasını sağlar. Sadece bu yana ~ 50 T-hücrelerinin bir dilim kültürü (~ 55,000-90,000 toplam hücreleri) bulunur, biz RT 2 nano PREAMP cDNA Sentezi Kiti IFN-λ potansiyel ultra-düşük düzeyde ifade algılamak anlamına gelir. CDNA amplifikasyon Bu demektir ki, hassasiyet seviyeleri RNA 12 kat artış sağladı. Yukarıda gösterilen sonuçlar algılama duyarlılığını artırmak için amplifikasyon kapasitesini göstermektedir. Ct referans gen Rpl13a için eşik ilk amplifikasyon ile 20.5 idi ve bu amplifikasyon kiti, 12 cDNA PCR döngüsü karşılık gelen 12 kat artış ile 14,1 arttı. Buna paralel olarak, IFN-λ algılanamaz (0.0) ama içinde amplifikasyon ile algılama aralığı (29.0) oldu.

Şekil 7
Şekil 7. Doğuştan sitokin yolu phosphoprotein fosforilasyon değişir. (A) doğuştan sitokin yolu phosphoprotein fosforilasyon 24 saat hipokampal dilim kültürlerde eksitotoksik yaralanma sonrası TNF-α Örnek etkisi tedavi öncesi (yani, nöro-). Bulgular, NMDA tek başına (yani, deneysel vs plasebo) maruz göre N-metil-d-aspartat (NMDA) maruz önce 100 ng / ml, TNF-α ile 3 gün boyunca ön tedavi dilimleri arasında CA1 alan değişiklikleri göstermek olarak ifade yüzdesi. TNF-α, JNK ve ATF-2 kalıcı bir fosforilasyon artışın yanı sıra NFκB bir geçici bir artışa neden olduğu dikkat edin. (B) NFκB aktivasyon (yani, çekirdeğindeki fosforile NFκB varlığı) mekansal dağılımının, (immün tarafından ortaya kırmızı). [Astrositlerde örneğin, (ok başı)] bir dilim kültür bölümünde YoYo lekeleri çekirdekleri yeşil. Aksi ayrıca yeşil görünür piramidal nöronlar, fosforile NFκB (kırmızı) ile eş zamanlı işaretleme nedeniyle yerine sarı. Kalibrasyon bar, 25 mm.

Şekil 8
Şekil 8. 200, 500 uygulamasından sonra 3 gün küresel hipokampal dilim Siklofilin B ifade azaltılması; siRNA verimlilik Proteomik onay Siklofilin B peroksidaz diaminobenzidin tabanlı İmmünoboyama Farklılaştırılmış gümüş yoğunlaşması, siRNA anlamlı (ANOVA-Holm-Sidak yöntemi p <0,001) gösterir ya da 1.000 nM siRNA.

Discussion

SD nitelikleri bugüne kadar bütün türlerin ve beyin bölgelerinde son derece korunmuş incelendiğinde beynin bir paroksismal pertürbasyon. SD neokorteks yaygın olarak incelenmiştir. Ancak, bu yapının nöral devre karmaşıklığı (hipokampus ile karşılaştırıldığında) yanı sıra uzun süreli dönemler için sükunet bağışıklık fonksiyonları ile in vitro neokorteks canlı tutmak için yetersizlik, uzun vadeli sonuçları tanımlamak için in vitro hazırlık olarak daha az kullanışlı hale SD duyarlılık. Buna karşın, hipokampus sadece SD en hassas olan beyin yapısı, aynı zamanda nöral aktivitenin SD duyarlılık modüle hangi neuroimmune anlamı tanımlamak için de uygundur daha basitleştirilmiş bir nöral devre yapısı ve fonksiyonu, bir archicortical yapıdır .

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme (NS-19108), Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (PO1-HD09402), Migren Araştırma Vakfı ve Beyaz Vakfı hibe ile desteklendi. Bayan Marcia P. Kraig kültür sistemlerinin hazırlanması ve bakım yardımcı oldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium

Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes

Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup

Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures

Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification

Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening

Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay

Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry

Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28, (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6, (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60, (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51, (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55, (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44, (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, (1), 93-108 (1996).
Yayılma Depresyon Episodik ve Kronik Migren Sinir Bağışıklık Sinyalizasyonu Modelleme<em> In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter