Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

النمذجة اشارة المناعة العصبية من الصداع النصفي العرضية والاكتئاب المزمن عن طريق نشر في المختبر Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Neurology and Committee on Neurobiology, The University of Chicago Medical Center, 2Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

الصداع النصفي والصداع النصفي تحولها إلى أعباء الرعاية الصحية المزمنة هي في حاجة هائلة من الخيارات تحسين العلاج. نسعى الى تحديد كيفية يشير المناعي العصبي ينظم التعرض للالصداع النصفي ، على غرار

Abstract

الصداع النصفي والصداع النصفي تحولها إلى أعباء الرعاية الصحية المزمنة هي في حاجة إلى تحسين خيارات العلاج. نسعى الى تحديد كيفية يشير المناعي العصبي ينظم التعرض للالصداع النصفي ، وعلى غرار في المختبر باستخدام الاكتئاب ينتشر (SD) ، كوسيلة لوضع أهداف علاجية جديدة لالصداع النصفي العرضية والمزمنة. SD هو السبب المحتمل لهالة الصداع النصفي وآلام الصداع النصفي. وهو فقدان وظيفة الخلايا العصبية الانتيابي الناجمة عن زيادة نشاط الخلايا العصبية في البداية ، والذي ينتشر ببطء داخل مناطق الدماغ عرضة للإصابة. عادية وظيفة الدماغ حساس بشكل رائع ل، وتعتمد ، تتزامن على مستوى منخفض يدل المناعي. وهكذا ، يشير المناعي العصبي يؤثر على النشاط الكهربائي من المرجح SD ، وبالتالي الصداع النصفي. دراسات الإحساس بالألم من SD في الحيوانات كلها محفوفة بالصعوبات ، بل هي مناسبة تماما لفحص الحيوانات كلها جوانب بيولوجيا الأنظمة من الصداع النصفي منذ SD ينشط المسارات nociceptive مثلث التوائم. ومع ذلك ، لا يمكن أن الدراسات الحيوانية كلها وحده يمكن استخدامها لفك الآليات الخلوية والدوائر العصبية من SD. بدلا من ذلك ، في التحضيرات المختبر حيث يمكن التحكم في الظروف البيئية اللازمة. هنا ، من المهم أن ندرك حدود شرائح الحادة ومزايا واضحة للثقافات شريحة الحصين. يمكن شرائح الدماغ الحادة لم تكشف عن التغييرات الطفيفة في الإشارة المناعي منذ إعداد شرائح المشغلات وحده : الموالية للالتهابات التغييرات التي الماضي يوما ، وسلوك صرعي بسبب المستويات العالية للتوتر الأوكسجين اللازم لتنشيط الشرائح ، لا رجعة فيه واصابة الخلية في مراكز شريحة نقص الأكسجين.

في المقابل ، يشير ندرس المناعي في شريحة ناضجة الثقافات الحصين منذ الثقافات توازي في الجسم الحي مع نظيره الدالة trisynaptic ناضجة ، تظهر الخلايا النجمية هادئة ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، ومستويات خلوى ؛ ويتسبب بسهولة في إعداد SD unanesthetized. وعلاوة على ذلك ، فإن شرائح طويلة الأمد ويمكن أن يتسبب SD في أيام متتالية دون وقوع إصابات ، مما يجعل هذا المستحضر الوسيلة الوحيدة القادرة على أحدث نماذج من العواقب neuroimmune من SD المزمن ، والصداع النصفي المزمن وبالتالي ربما. نحن نستخدم تقنيات الكهربية والتصوير غير الغازية لقياس الخلية العصبية ووظائف الدوائر تتزامن مع SD. تقاس العصبية التعبير الجيني المناعي مع المتغيرات الفرز qPCR ، صفائف qPCR ، والأهم ، واستخدام preamplification [كدنا] للكشف عن مستوى الأهداف المنخفضة جدا مثل انترفيرون غاما به كله ، والإقليمية ، أو محددة تعزيز خلية (عن طريق التشريح المجهري ليزر) أخذ العينات. ويتم تقييم المزيد من تتالي إشارات خلوى مع الأهداف ذات الصلة مع بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين المضاعفة التعبير الجيني والتغيرات بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين أكد عبر خلية محددة immunostaining. تستخدم استراتيجيات الدوائية وسيرنا وتعدل لتقليد إشارات المناعي SD.

Protocol

عدة نقاط تستحق التأكيد للدراسة الناجحة للإشارات SD المناعية ذات الصلة في شرائح الدماغ. أولا ، يجب الشروع في المحفزات يزيل الاستقطاب بشكل متزامن حجم كاف من المادة الرمادية في الدماغ لبدء SD. وهذا يعني تكوين واجهة (أي أقل من التعرض للسوائل الغاز فقط ، وتبادل الثقافة أعلاه إدراج شريحة) هو مطلوب. 1،2 ثانيا ، الحفاظ على شرائح الدماغ الحاد SD لكن الصدمة من إعدادها ، فضلا عن استخدام 95 ٪ من الأوكسجين الغازي حل رينغر توليد الموالية للالتهابات التغييرات وسلوك صرعي على التوالي ، والذي يمكن أن يغير العصبية الدالة الدائرة وتوازن المناعة. 3 الثالثة ، في حين الثقافات شريحة الحصين التغلب على هذه القيود شريحة الحادة ، فمن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي الحفاظ على الثقافات شريحة لفترات كافية قبل استخدام (أي أكبر من 10 أيام في المختبر) بحيث تصبح الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية هادئة. 3-5 وأخيرا ، يجب أن تحاسب SD باستخدام تقنيات معقمة وخالية من الجراثيم. وقد صممت هذه التقنيات المذكورة أدناه لتلبية هذه الحاجة.

1. انتشار الكساد في الثقافات شريحة

  1. إعداد والثقافة ، والصيانة.
    1. وتعد شريحة الثقافات والحفاظ عليها في مصل المتوسطة المستندة الحصان أو المتوسطة المصل الحرة (SFM) 6،7 كما هو موضح سابقا (8) مع تعديلات طفيفة على المتوسط. معلمات الحضانة هي 36 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ الرطوبة الجوية التوازن.
      1. نجد أن الثقافات يمكن أن تنتقل إلى SFM بعد 18 يوما في المختبر ، وحافظت على الأقل 35 يوما في المختبر باستخدام SFM لدينا المعرفة مسبقا التي تشمل الكالسيوم والمغنيسيوم إضافية.
      2. بالإضافة إلى ذلك ، والمضادات الحيوية antifungicide تضاف لمنع التلوث المعدية المرتبطة تسجيل حلقات متعددة.
      3. هذا على المدى الطويل صياغة المتوسطة (أو تسجيل) يحتوي على (لكل 100 مل) : Neurobosal المتوسطة ، و 97 مل ؛ جوهرة - 21 ، 2.0 مل ؛ Glutamax (200 ملم) ، و 0.5 مل ؛ الجنتاميسين (10 ملغ / مل) ، و 10 ميكرولتر ؛ مد الجلوكوز (45 ٪) ، 680 ميكرولتر ؛ حمض الاسكوربيك (0.5 م) ، و 100 ميكرولتر ؛ Fungizone ، (250 ملغ / مل) ، و 400 ميكرولتر ؛ كلوريد الصوديوم (5.0 م) ، 820 ميكرولتر ، 2 ملغ الكلورين 2 (1.0 م) ، ميكرولتر 80 ؛ CaCl 2 (1.0 م) ، 160-240 ميكرولتر.
      4. وتستخدم لأغراض التنمية المستدامة الثقافات 21-35 يوما في المختبر.
    2. التحقق الحيوية. 3،6،7
      1. يتم فحص الثقافات عن أدلة على وفاة الخلايا العصبية الهرمية قبل الاستخدام.
        1. في 18 يوما في المختبر ، يتم إدراج المحتضنة لمدة 20 دقيقة في المتوسط ​​(في ظل ظروف طبيعية الحضانة) التي تحتوي على 5 ميكرومتر Sytox الأخضر ، الذي يصبح علامة فلوري عندما يربط الحمض النووي (أي عن طريق اختراق في الخلايا الميتة).
        2. ثم يتم نقلها مرة أخرى إلى إدراج المتوسطة السابقة ودرست مع مضان المجهري (504 الإثارة وانبعاث 523) للحصول على أدلة من CA3 أو الهرمية CA1 إصابة طبقة الخلايا العصبية.
          1. تم استبعاد شرائح مع أكثر من 20 زنزانة ، أو مستوى قياسي أكبر من 250 وحدة دولية مضان من استخدامها مرة أخرى.
  2. مواد التصنيع.
    1. مصنوعة أقطاب الأرض مع أنابيب زجاجية (2.0 مم OD / 1.16 ملم معرف) لقطع أطوال 4.5 مم والنار لفترة وجيزة المصقول في كلا الجانبين.
      1. نحن جعل نحو 20 الأقطاب في وقت واحد ، والتي يمكن أن تستمر لأكثر من عام.
      2. جلب 100 مل من بوكل 1M لتغلي ، وتضاف مع التحريك ، أغار ز 3.5 و 0.5 غ EDTA (ملح الصوديوم ethylenediaminetetraacetic حمض ثنائي الهيدرات) لإنتاج حل واضح الصفراء.
      3. استخدام أنابيب بطول قصيرة من مرونة تركيبها على كل أنبوب زجاجي لرسم الحارة بوكل / آغار حل في أنابيب زجاجية وكذلك على بعد مسافة قصيرة في أنابيب مرنة.
        1. شفط الإفراج عنها والسماح للبوكل / أجار لبالتنقيط ببطء للخروج من غيض من فتح أنبوب زجاجي ، ثم اضغط على فتح أنبوب زجاجي طرف ضد قطعة من الجليد.
        2. فإن المناورة الأخيرة للمطالبة آغار هلام في طرف القطب وليس الجل بعد تراجع احتياطي في أنبوب زجاجي.
      4. مرة واحدة في آغار وتبلور في المياه الباردة تشغيل ، يمكن إزالة أنبوب مرن دون تغيير آغار المتمركزة في أنابيب زجاجية.
      5. مكان 0.5 مل من بوكل M 1 في كل بئر من رف 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. ثم ضع طرف واحد من كل أنبوب بوكل / آغار زجاجية مملوءة في الآبار الفردية.
      6. المقبل ، عقد طول 80 سم من سلك قياس 15 الفضية مع مرقئ ونظيفة من كل الجوانب الأربعة عن طريق كشط السلك من خلال عقد مجلس إيمري إلى الأعلى العداد.
      7. قطع الأسلاك في أطوال 4 سم ووضعها في قارورة التلألؤ مليئة التبييض لمدة 20-30 دقيقة لوضع شركة AG - AgCl معطف على سطح الفضة تنظيفها.
      8. ينحني كل سلك في النصف وتضاف الى النهايات الحرة واحدة من نهاية أنبوب زجاجي شغل وايال بوكل / آغار ، وترك حوالي 4-6 ملم المكشوفة.
      9. أخيرا ، ومعطف ساق أنبوب زجاجي يحتوي على أسلاك فضية وبقدر صغير من السلك مع المادة اللزجة ، والغراء مقاوما للماء ومرنة ، لمنع بوكل / أغار من التجفيف. أكرر للجميع الأقطاب. اسمحوا الغراء جافة بين عشية وضحاها.
      10. مخزن الأقطاب عند 4 درجة مئوية في قارورة التلألؤ (5-6 أقطاب / فيال) التي تحتوي على ~ 5 مل 1 م و 25 ملغ بوكل من EDTA ، الذي يؤخر بشكل ملحوظ نمو البكتيريا.
    2. أقطاب كهربائية مصنوعة من تسجيل قطرها 1.5 مم (0.86 ملم معرف ؛ طول 10 سم) مع أنابيب زجاجية البورسليكات شعيرات (فيديو الشكل 1).
      1. سحب microelectrodes إلى الحافة مع غرامة أنابيب زجاجية قصيرة انسحب الى نقطة حادة.
        1. نحن عادة سحب أقطاب ~ 7.5 سم في الطول مع تفتق 1 سم. وهذا يسمح لتحديد المواقع المناسبة ومسرى التصور الحافة.
        2. يتم سحبها مع أقطاب مجتذب Narishige PE - 2.
        3. يتم تقسيم نصائح Microelectrode العودة الى 2-4 ميكرومتر في إطار التصور باستخدام المجهر المركب مزودة ميكرومتر بصري معايرة. نستخدم حافة شريحة زجاجية الأنسجة القياسي (25 × 75 × 1 ملم) تعلق على micromanipulator أحادية البعد الهيدروليكية التي عقدها آخر تتلاعب 3 الأبعاد لكسر بلطف نصائح microelectrode.
          1. الأولى ، هي التي شنت القطب تعلق على شريحة المجهر باستخدام الطين.
          2. ثم توضع الشريحة على المجهر حامل الشرائح التي تستخدم لنقل معلومات سرية microelectrode بالقرب من حافة الزجاج انزلق تعلق على تتلاعب الهيدروليكية.
          3. أخيرا ، يتم تقسيم بلطف غيض من microelectrode عن طريق الضغط عليه حتى ضد حافة الشريحة المجهر مدفوعة هيدروليكيا.
    3. والملتوية أقطاب كهربائية تحفيز القطبين الأسلاك بسبب :
      1. أنها تسمح للتسجيل امكانات الحقل أثار ، الذي لم يفعل ذلك سيتم حجب من القطع الأثرية من التحفيز التحفيز أحادي القطب.
      2. يمكن أن يكون الكهربائي بين القطبين تحفيز تطبق بلطف على السطح التلفيف المسنن دون وقوع إصابات ، على خلاف حاد بين القطبين الأقطاب الكهربائية ذات الرؤوس.
      3. أخيرا ، وتطبق الحالية مترجمة إلى السطوح (العارية) عرضية دائرية من الأسلاك المعزولة التفلون المستخدمة في القطب.
        1. حفز التصنيع الكهربائي تبدأ قطع * 20 سم طول من الايريديوم والبلاتين (125 قطرها ميكرون عارية ؛ قطرها 200 ميكرون مغلفة) وتفلون الأسلاك المغلفة. ثم ينحني في نصف طول وربطة عنق وتنتهي في عقدة فضفاضة مربع فضفاضة ، وترك ~ 2 سم من عقدة إلى نهايات السلك.
        2. تأمين عقدة في تشوك من ناحية الحفر الكهربائية وضعت على الطاولة.
        3. بينما يمسك الطرف الآخر من السلك مع مرقئ ، بدوره لفترة وجيزة وإيقاف الحفر حتى سلك الملتوية بإحكام (أي كل سطح قطع ستكون على مسافة متساوية من جهة أخرى عندما يتم قطع سلك في الاتجاه العرضي دون انهيار ).
        4. المقبل ، وتنتهي العارية من الأسلاك الملتوية البلاتين الايريديوم بحاجة إلى أن ترفق لقيادة الأسلاك المستخدمة لربط الكهربائي لتحفيز المعزل التحفيز.
          1. يتم ذلك عن طريق ينتهي حام خالية من سلك البلاتين إيريديوم إلى ~ الأسلاك قياس 30 50 سم.
          2. أولا ، الشريط سلك البلاتين إيريديوم الملتوية إلى الأعلى مقاعد البدلاء ، وإسقاط بركة من حمض الهيدروكلوريك تتركز على نهاية واحدة خالية من الأسلاك الملتوية.
            1. المقبل ، تجريدها من حوالي 1 سم من العزل من كل سلك باستخدام مقص السلك.
            2. وضع نهاية جردت على سلك الرصاص بجوار نهاية الأسلاك الملتوية وتطبيق الحرارة من الحديد الجميلة ذات الرؤوس لحام ، لحام ذلك الحين وحتى وترد بحزم السلكين.
          3. زلة طول أنابيب صغيرة من الانكماش الحراري عبر اتصال الأسلاك المكشوفة وانها تتناسب مع تقليص الحرارة.
          4. تكرار للسلك الثاني.
          5. النار تلميع غيض من ماصة باستير 15 سم وتوجيه الملتوية سلك البلاتين إيريديوم ماصة أسفل حتى حوالي 6 سم يبرز من خارج الملتوية.
          6. استخدام الايبوكسي مضادة للماء (على سبيل المثال ، JB ولد) لختم كلا طرفي القطب.
          7. أخيرا ، نعلق المقابس الموز إلى نهايات الأسلاك يؤدي للاتصال المعزل التحفيز.
          8. تحت الملاحظة مجسمة ، ضع طرف القطب في برنامج تلفزيوني والبحث عن الفقاعات تنتج الكهربائي قادمة من نهاية الوحيد قطع من نصائح الكهربائي. إذا أي فقاعات تأتي من الجانبين من الأسلاك الملتوية ، وقطع الكهربائي مع خفض استخدام مستعرض جديدة الحلاقة حافة شفرة واحدة لاعادة عزل سليمة إلى محاور سلك طويل.
          9. عند استكشاف لحل آثار التحفيز الشاذة ، في محاولة صنع حديثا غيض الكهربائي قطع.
    4. تسجيل تتكون من أطباق وقمل إدراج الثقافة في صحن الثقافة 35 ملم الذي يجلس على اثنين من 1.0 × 12 ملم قضبان الزجاج متباعدة عن 1.0 سم عن بعضها البعض. نعلق قضبان الزجاج الى قاعدة الطبق عن طريق تسخين أنابيب زجاجية ثم الضغط عليهم في قاعدة بالملقط.
      1. لظروف تسجيل ثابت ، إضافة 1.5 مل من المتوسط ​​إلى الطبق.
      2. المقبل ، بلل قطعة سم ~ 10 ملم واسعة وطويلة من 3-4 القطن المعقمة في 1.0 مل من المتوسط. طوى القطن في نصف طول المحور الطويل ووضعه على طول جيدا الداخلية على إدراج مع ملقط معقم. القطن الرطب يساعد في الحفاظ على الرطوبة الطبق.
      3. متباعدة بالتساوي ثلاثة أطوال انضغاط 4 ملم من الأنابيب حول إدراج.
      4. تغطية صحن وثيق مع فيلم البولي فينيل كلورايد ، والتي تسمح بتبادل الغازات.
      5. قطع نحو منتصف الحائط العمودي مع شفرة الحلاقة حافة واحدة لإزالة الزائدة فيلم البولي فينيل كلورايد.
  3. الكهربية الإعداد
    1. يتم وضع شريحة إدراج الثقافة التجمع في غرفة تسجيل PDMI التسجيلات الكهربية.
      1. تتناول الجمعية طبق إدراج / الثقافة في غرفة PDMI بواسطة قرص بلاستيكية سميكة 2 مم مزودة بغرفة PDMI ، مع فتحات صغيرة مختلفة حسب الحاجة لوضع أقطاب التسجيلات والمتوسطة تدفق / تدفق الأنابيب ، الخ.
      2. نقوم بمراقبة دورية الحموضة المتوسطة مع القطب تركيبة الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة مصغرة مع نوع T مصغرة الحرارية المركبة المسبار الى microelectrode شبه مغلقة لضمان 7.3 درجة الحموضة و36.0 ° C الظروف.
      3. غير الهوائية الغرفة إدراج / 5 ٪ مع الهواء ثاني أكسيد الكربون والتوازن ويقام إما متوسطة ثابتة أو في تدفق (1.2 مل / دقيقة) مع مركز التكوين إدراج عقد في 35-36 درجة مئوية.
      4. لظروف التدفق ، وارتفعت درجة حرارة متوسطة مع سخان مضمنة ، ومرة ​​أخرى للحفاظ على مركز للغرفة تسجيل عند 36 درجة مئوية.
        1. نظام مضخة تمعجية مع تخفيف الضغط المتوسط ​​يجلب الى لثقافات شريحة دون نبضات من المضخة. يتم استخدام الشافطة الموردة مع الغرفة PDMI لإزالة المتوسطة من خلال إدراج الشفط لطيف.
      5. للاستقرار ، هي التي شنت على غرفة مصممة خصيصا بيرلي وجبل طارق مرحلة المجهر المقلوب الذي يحمل المجهر المقلوب ويجلس على طاولة الاهتزاز الحرة.
      6. يتم فتح ثقوب صغيرة من خلال إدراج البولي فينيل كلوريد مع التفاف صغير ، مكواة الأداة التي تعمل بالبطاريات.
      7. المقبل ، إذا كان التكوين تدفق لاستخدامه ، هو مدخل وبدأ تدفق مأخذ ، يليه وضع قطب كهربائي الأرض. خلاف ذلك ، ببساطة القطب الارض في المكان.
      8. يتم وضع الأقطاب ، الذي عقد في مكان مع micromanipulators ، فوق شريحة تصور مع مجهر مقلوب في التكبير 5X (الشكل 1).
        1. ويبدأ تسجيل تليها القطب القطب محفزة.
        2. نستخدم رصد الصوت أن نلاحظ عند microelectrode يجعل الاتصال مع شريحة. يتم وضع الطرف في منتصف طول الهرمية CA3 طبقة الخلايا الجسم.
        3. وبدأت التسجيلات ، ومن ثم يتم التطرق بلطف تحفيز الكهربائي إلى السطح منتصف التلفيف المسنن.
        4. في كلتا الحالتين ، يتم إنجاز القطب الحركات الأولية مع الضوابط الخشنة ، وتحديد المواقع النهائي فقط مع الضوابط ، وغرامة الهيدروليكية باستخدام الإضاءة على النقيض مرحلة بحيث يمكن أن طبقات خلايا الجسم تمييزها بسهولة.
        5. أقطاب مسبقا بزيادات ~ 25 ميكرون تحت التصور المجهرية المباشرة.
        6. بمجرد لمس أقطاب الأنسجة ، ودفع أقطاب أخرى ميكرومتر 20-30.
        7. وبدأت التسجيلات قبل وضع تحفيز كهربائي في مكان لتكون على يقين من أن هذا لا يؤدي SD (أي من خلال التحفيز الميكانيكي).
        8. ويسمح ~ 10 دقائق لمرور قبل البدء بالتجارب.
  4. يسببها Transynaptically SD.
    1. أثار تحسين امكانات الحقل CA3 على النحو التالي (الشكل 2).
      1. وأثار احتمال CA3 الميدان مع البقول 100 ميكرو ثانية (0.2 هرتز) مع بداية الحالية غير كافية لتثير رد فعل (على سبيل المثال ، ~ 1-5 أمبير).
      2. تحرك القطب تسجيل بزيادات على طول محور عصبون هرمي يمر وقت طويل حتى إمكانات الحقل القصوى.
      3. ثم ، وزيادة التيار الكهربائي مع تسجيل موقف في هذه المذكرة والاستجابة القصوى الحالية (على سبيل المثال ، ~ 10-20 أمبير).
      4. وأخيرا ، استخدام نصف الكثافة القصوى للتجارب التحفيز (مثل مراقبة صورية التحفيز الدوري).
    2. تحديد عتبة SD أثار synaptically (الشكل 2).
      1. مع أقطاب تكوينه على النحو المبين أعلاه لامكانات الحقل أثار ، والتبديل النموذج التحفيز لرشقات نارية واحدة أثارت يدويانبضات من 10 (10 هرتز @ 100 ميكرو ثانية / نبض) ، وهو نموذج طبق سابقا في الدراسات الحيوانية كلها.
      2. زيادة كثافة تدريجيا الحالية في انفجار التحفيز حتى يتم تشغيل SD. الانتظار على الأقل 60-120 ثانية بين المنبهات.
      3. تقرير SD العتبة في المعلقات (أي الوقت الحالي خ).
    3. في التجارب الأخرى التي تتطلب قياس ردود على تحريض الانحرافات المعيارية متعددة ، واستخدام القوة من المرجح أن تثير الحوافز SD (على سبيل المثال ، ~ 100-500 NC).
      1. SD الزناد كل دقيقة 9 لمدة ساعة.
      2. تأكد من استخدام التقنيات العقيم طوال التجارب.
      3. بعد SD الماضي ، إعادة إدراج الثقافة الحضانة لظروف طبيعية.
        1. علامة الطبق الثقافة أن نلاحظ أن ثقافة شهدت SD.
        2. عادة لدينا لوضع علامة واحدة إلى اليسار وعلامتي بحق شريحة إدراج الثقافة ، مشيرا إلى كل من الثقافات الثلاث باعتبارها # 1 ، # 2 ، و 3 # من اليسار إلى اليمين.
        3. تغيير متوسطة كل 3-4 أيام حتى الحصاد الثقافة.
    4. لأغراض التنمية المستدامة المتكررة ، اتبع الإجراءات المذكورة أعلاه.
    5. نحن عادة لاختبار تغيير في عتبة SD 1 و 3 و 7 و 14 يوما بعد ساعة الأولي من الانحرافات المعيارية متعددة.
    6. وتسجل منطقة CA3 سريع التغيرات المحتملة المحتملة وبطيء عن طريق منفصل نظم معالجة الاشارات الرقمية.

2. التصوير المثالي الحيوية في الثقافات شريحة الحصين

  1. وبالمثل يمكن أن السلوك الوظيفي الحيوي للخلايا المناعية المقيمين (أي الخلايا الدبقية الصغيرة) يمكن رصدها في الثقافات شريحة دون وقوع إصابات أو خلية التنشيط المناعي (الشكل 3) 9
    1. على سبيل المثال ، لتسمية الخلايا الدبقية الصغيرة لتقييم حركتهم المرتبطة بالتغيرات النشاط متشابك من SD ، استخدمنا fluorophore الموسومة isolectin - IB 4.
    2. "PBS Lectin" هو برنامج تلفزيوني مع الكاتيونات إضافية (0.1 ملم كل CaCl 2 ، MgCl 2 ، MnCl 2) منذ مطلوبة الكاتيونات ثنائي التكافؤ (0،1-1،0 مم) لربط lectin إلى α - D - galactosyl شاردات على أغشية الخلايا دبقية صغيرة.
    3. تقديم حل "PBS Lectin" :
      1. برنامج تلفزيوني عن 1 لتر ، وذلك باستخدام تقنية العقيم والترشيح عقيمة ، إضافة :
      2. 100 ميكرولتر من MgCl 1M 2
      3. 100 ميكرولتر من MnCl 1M 2
      4. 100 ميكرولتر من 1M CaCl 2
    4. مزيج دقيق من الجمع بين ويحفظ في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
      1. وهناك حاجة سوى 500 ميكرولتر من "PBS lectin" لكل فيال من isolectin ، ولكن نظرا لأنه يمكن أن تكون مبردة والاحتفاظ بها لمدة أشهر في وقت واحد ، قد يكون من المفيد لتعويض كميات أكبر.
    5. AlexaFluor إعادة 594 الموسومة isolectin - IB4 (isolectin) مسحوق مجفف بالتجميد to1 ملغ / مل في "برنامج تلفزيوني lectin".
      1. من أجل تقليل photobleaching ، تنفيذ هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن ، والتقليل من التعرض للضوء.
      2. يمكن aliquoted Isolectin إلى 20 ميكرولتر أعيد مرة واحدة في 1mg/ml والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى سنة واحدة.
      3. تمييع isolectin إلى 20 ميكروغرام / مل في وسط النمو والثقافات احتضان شريحة في الظروف العادية حضانة 4-10 ساعات قبل التصوير.
    6. التصوير انشاء.
      1. التصوير انشاء يتكون من : ، مجهر الكاميرا ، مصراع الكاميرا ، والضوء ، 2.0 محايدة مرشح الكثافة ، و 36 درجة مئوية ، والغاز : 5 ٪ CO2 ، والهواء (أو 20 ٪ الأكسجين والنيتروجين التوازن).
      2. بدوره على المجهر والكاميرا ، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، ومراقبة درجة الحرارة ، والغازات ما لا يقل عن ساعة واحدة قبل التصوير.
    7. إعداد MetaMorph التصوير البروتوكول.
      1. من "مجلة" القائمة المنسدلة ، اختر "تشغيل مجلة...".
      2. هذا يجب ان يدفع فتح مجلد المجلات ، والتي يجب تحديد "موشن W - AFS فار (مجلة أنشئت في وقت سابق ان يتبع الخطوات التالية)" ، انقر فوق "فتح".
      3. في "ضبط تلقائي التردد" نافذة سوف يطفو على السطح المقبل ، والحفاظ على الرقم 1 ، انقر على زر "موافق".
      4. المقبل ، وإعداد "ملف تتابعي نا..." نافذة سوف يطفو على السطح ، والحفاظ على كل شيء كما هو :
        1. اسم القاعدة : صورة ؛
        2. عدد الصور : 1 ؛
        3. العرض رقم : 3 ؛
        4. حفظ كنوع : MetaMorph TIFF ؛
        5. إذا كانت الصورة موجودة بالفعل --> الكتابة تلقائيا ؛
        6. انقر على "دليل حدد..."، هذا سوف يتسبب في" استعراض للمجلد "نافذة ليطفو على السطح. هنا ، حدد المجلد (أو إنشاء مجلد جديد) حيث يجب أن يتم حفظ الإطارات الفيلم.
        7. ثم ، عندما المجلد الصحيح : يتم عرض (على سبيل المثال مجلد C \ \ بيانات جديدة) في الجزء السفلي من "إعداد ملف تتابعي نا..." النافذة ، وانقر على زر "موافق".
        8. في إطار الحصول على :
          1. حدد الإعداد في أسفل الزاوية اليسرى لتكون DiIMGBIN2 ؛
          2. "زمن التعرض" : 20ms "؛ Binning" : 1.
        9. ثم في التبويب الخاصة :
          1. "الوضع حساس" : FT ؛
          2. "أصابعذر ": 10MHz (EM ربح) ؛
          3. "كسب" : Gain3 (3X) ؛
          4. حدد "EM التغابن : 45" ؛ مصراع الكاميرا : مفتوح للكشف ؛ وضع مسح : EXP PRE اضحة ؛ عدد تشفير : 2 ، ووضع الزناد لايف وضع الزناد : عادي (توقيت).
        10. "الإطارات إلى المتوسط" : 3.
        11. انقر فوق "إغلاق".
    8. بعد إعداد MetaMorph التصوير ، ومكان إدراج في صحن الثقافة 35mm مع اثنين من قضبان الزجاج 1 مم في القاع.
      1. بعد ثلاثة ملم 2 قطعة من أنبوب مطاطي المجهزة بين جدران الصحن وإدراج الثقافة لزيادة استقرار إدراج.
      2. مكان قطعة ~ 10 ملم واسعة من القطن غارقة في وسط إضافية 1 مل داخل إدراج للحفاظ على البيئة مرطب. تأكد من أنه هو مطاردة مع الجدران ، وبعيدا عن الشرائح الحصين.
      3. يغطي الجزء العلوي من طبق الثقافة بشكل وثيق مع فيلم البولي فينيل كلورايد لمنع فقدان السوائل.
    9. تأكد من أن التركيز في التصوير هي طبقة الخلايا الهرمية CA3. ملاحظة اتجاه شريحة من قبل التقاط الصور في المرحلة 10X ، 5X ، و20X.
    10. في إطار "البحث عن التركيز" التي تظهر على الشاشة ، وتعيين نطاق والحالية + / -- أن يكون "8" ، والدقة ، في ميكرون (ق) ، أن يكون "1" (يجب أن يتم التحقق كلا المربعين في الأسفل) .
    11. انقر على زر "البحث تركز" لضمان وجود الصورة في التركيز.
    12. في إطار "اكتساب Timelapse" ، حدد الفاصل الزمني لتكون "1 دقيقة" ، والمدة لتكون "6 ساعات" (هذه هي معاييرنا اقتناء المفضل).
      1. لالتقاط بدقة تحركات دبقية صغيرة ، يجب أن يكون التصوير لم أقل تواترا من مرة واحدة في الدقيقة.
    13. في تخزين الصور ، حدد المكدس.
    14. وينبغي التحقق من نافذة الصورة مربع التحديث ، ولكن ليس غيرها من مربعي تحتها.
    15. حدد "Illum" لتكون "لامدا".
    16. انقر على زر "موافق".
    17. والفيلم يبدأ الآن للتشغيل. وهذا يعني أنه لا يمكن أن يؤديها أي شيء آخر في إطار برنامج MetaMorph حتى انتهاء الفيلم أو حتى التوقف عن الفيلم في وقت مبكر عن طريق النقر على Esc ، وبعد ذلك الفيلم سوف تتوقف بعد ذلك في الخطوة التالية اكتساب الوقت المناسب.
    18. في نهاية الفيلم ، وتحقق من وجود إصابة الخلية عن طريق الفحص Sytox كما ذكر أعلاه (A).

3. استخراج الحمض النووي الريبي لمنخفض المستوى سايتوكاين اشارة 11-15

  1. طرحناها سابقا تعليمات مفصلة للكشف عن مستوى منخفض خلوى يشير في الثقافات باستخدام شريحة qPCR والتقنيات مجموعة PCR. 6،7
  2. لقد قمنا بتحسين ملحوظ في حساسية للكشف عن نهجنا مرنا خلوى في الثقافات شريحة والحاضر هذه التحسينات هنا.
  3. وتتضمن التحسينات نهجنا لحصاد الأنسجة والعزلة RNA ، الغربلة من العينات لعامل نخر الورم ألفا (TNF - α) التغيير ، وpreamplfication [كدنا] ، والتي هي ~ 6 مرات أكثر حساسية من التقنيات السابقة ، وعلى سبيل المثال ، تسمح للكشف المرة الأولى للثقافة شريحة انترفيرون غاما (الإنترفيرون λ) الكشف عن 15
  4. PCR التحضير.
    1. شريحة الثقافة الحصاد.
      1. وغرقت التجارب التالية ، وتدرج في الجيش الملكي النيبالي ثقافة شريحة مل 2-3 في وقت لاحق وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام حتى مزيد من المعالجة.
      2. إلى الحصاد ، وإزالة دخيلة (أي ، أي الأنسجة المتاخمة للقرن آمون سليمة) الأنسجة باستخدام سكين الماس ورفع الشرائح الفردية في ريبونوكلياز / الدناز الحرة 1.5 مل أنابيب أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على الفوسفات 0.5 مل العقيمة مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الطلاء غرامة يميل الفرشاة.
      3. عينات تدور (10،000 دورة في الدقيقة × 1 دقيقة) بطريقة النمطية حتى يتسنى لجميع شرائح التمسك نفس الجانب من الأنابيب الخاصة بهم.
      4. إزالة برنامج تلفزيوني وطاف في 500 عينة resuspend TRIzol ميكرولتر.
      5. عينات في مخزن -80 درجة مئوية أو حتى الحفاظ على الجليد استخراج الحمض النووي الريبي.
    2. استخراج الحمض النووي الريبي usingTRIzol مع نتائج عدة مايكرو RNeasy في غلة أكبر الحمض النووي الريبي (الشكل 4) من استخدام عدة وحدها.
      1. أذاب TRIzol - العينات واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. فصل الأنسجة بواسطة سحب عينات صعودا وهبوطا مع 1 مل يميل pippetor و / أو الأنسجة الصلبة vortexing حتى لم تعد مرئية.
      3. إضافة 100 ميكرولتر ريبونوكلياز الحرة (RF) الكلوروفورم وعكس أنبوب 2-3 مرات إلى المزيج.
      4. احتضان 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، vortexing كل دقيقة.
      5. الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      6. طاف لنقل نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. يجب الحرص على عدم تعكير الواجهة.
      7. إضافة حجم مساو من درجة حرارة الغرفة RF 70 ٪ الصف البيولوجيا الجزيئية الإيثانول (~ 300 ميكرولتر).
      8. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
      9. متابعة الخطوات التالية في اتجاهات عدة RNeasy مايكرو :
        1. تطبيق نموذج لطابور RNeasy الصغيرة وضعت في collectio 2mLن الأنبوب.
        2. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية ، من خلال تجاهل تدفق.
        3. غسل العمود RNeasy مع 350 ميكرولتر RW1 العازلة.
        4. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية ، من خلال تجاهل تدفق.
        5. إضافة 10 UL الدناز محلول المخزون 1-70 RDD العازلة ميكرولتر ، مزيج بلطف.
        6. تطبيق 80 ميكرولتر من محلول الدناز مباشرة على الغشاء ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
        7. غسل العمود RNeasy مع 350 ميكرولتر RW1 العازلة.
        8. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية ، من خلال تجاهل وتدفق أنبوب.
        9. إضافة 500 RPE العازلة ميكرولتر إلى العمود RNeasy.
        10. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية ، من خلال تجاهل تدفق.
        11. إضافة 500 ميكرولتر RF 80 ٪ الصف البيولوجيا الجزيئية الإيثانول إلى العمود RNeasy.
        12. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة ، وتجاهل والتدفق من خلال أنبوب.
        13. مكان العمود RNeasy في أنابيب جديدة مع سقف مفتوح.
        14. أجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة (أي 14000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
        15. نقل العمود RNeasy لأنبوب microcentrifuge الترددات اللاسلكية.
        16. تطبيق 14 ميكرولتر RF المياه مباشرة إلى الغشاء.
          1. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة إلى أزل.
          2. عينات في مخزن -80 درجة مئوية ، أو مواصلة الخطوات المقبلة.
    3. RNA الكمي.
      1. تمييع RiboGreen 1:200 في تريس 1X RF - EDTA (TE) العازلة.
      2. إعداد الخميرة الحمض الريبي النووي النقال لاستخدامه كمعيار الحمض النووي الريبي.
        1. يتم تخزين الأوراق المالية العاملة في -20 درجة مئوية في 100 ميكروغرام / مل
        2. تمييع إلى 1 ميكروغرام / مل (10 ميكرولتر في TE 990 ميكرولتر).
        3. وضع معايير على النحو التالي : للحصول على 100 نانوغرام / ميكرولتر ، إضافة ميكرولتر 100 ، لمدة 80 نانوغرام / ميكرولتر ، إضافة الحمض الريبي النووي النقال ميكرولتر 80 و 20 ميكرولتر TE ، لمدة 60 نانوغرام / ميكرولتر ، إضافة الحمض الريبي النووي النقال ميكرولتر 60 و 40 ميكرولتر TE ، لمدة 40 نانوغرام / ميكرولتر إضافة الحمض الريبي النووي النقال 40 و 60 ميكرولتر TE ميكرولتر ، لمدة 20 نانوغرام / ميكرولتر إضافة 20 و 80 ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال TE ميكرولتر ، و0 نانوغرام / ميكرولتر إضافة TE 100 ميكرولتر.
      3. تحضير العينات :
        1. تجمع 99 + 1 ميكرولتر TE عينة ميكرولتر.
        2. تشغيل كل عينة في مكررة.
      4. باستخدام pipettor متعدد القنوات ، إضافة 100 ميكرولتر من RiboGreen المخفض جيدا.
      5. ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج.
      6. قياس مضان على قارئ لوحة.
        1. فلوريسئين (485 نانومتر nm/535 ، 0.1 ثانية) البرنامج.
        2. تصدير النتائج إلى جدول بيانات Excel.
    4. تحديد الحمض النووي الريبي التركيز.
      1. الرسم البياني امتصاصية مقابل تركيز الحمض النووي الريبي ، وخلق أفضل تناسب خط الانحدار الخطي في Excel.
      2. تحديد عينة من الحمض النووي الريبي تركيزات معادلة الانحدار المرتبطة أفضل خط مناسبا.
    5. تحديد الحمض النووي الريبي الجودة.
      1. ويتم قياس الحمض النووي الريبي الريباسي سلامة الفرقة عبر agarose هلام (الشكل 4).
        1. على الرغم من أنه من غير العملي لتشغيل جزء من كل عينة الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها (منذ مطلوب = 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي والغلة لدينا هي صغيرة) ، انها فكرة جيدة لتشغيل دوريا agarose هلام على تغيير طبيعة العينة النموذجية كدليل على أن الأسلوب عندما يوظف بشكل صحيح ، والمحاصيل عالية الجودة الحمض النووي الريبي (اي دون تدهور).
        2. إعداد 1 ٪ agarose هلام (للاطلاع على حجم 100 مل).
          1. تنظيف خزان الكهربائي ، صب جل الدرج وأمشاط تماما مع ريبونوكلياز بعيدا.
          2. يزن 1 غرام من أصل agarose عالى النقاء في دورق.
          3. إضافة 83 مل من الماء مجانا ريبونوكلياز و 10 مل من اجتماعات الأطراف 10X [3 -- (N - Morpholino) propanesulfonic حمض] العازلة والميكروويف حتى يذوب agarose والحل واضح (~ 3 دقائق).
            1. لجعل اجتماعات الأطراف 10X العازلة
              1. الجمع بين اجتماعات الأطراف ز 83.7 ، 13.6 خلات الصوديوم غرام ، و 3.7 غ EDTA.
              2. إضافة 800 مل من الماء ريبونوكلياز مجانا ، مزيج حل.
              3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 والتعبئة للام 1
              4. تصفية أو تعقيم الأوتوكلاف.
              5. تخزين في درجة حرارة الغرفة ، ومحمية من الضوء.
          4. السماح لتبريد هلام إلى 55 درجة مئوية وإضافة 7 مل الفورمالديهايد بنسبة 37 ٪ (وينبغي أن يتم ذلك خطوة في غطاء الدخان الكيميائي).
          5. صب صب جل في الدرج ، والسماح لترسيخ هلام في غطاء محرك السيارة.
        3. تحضير عينات الحمض النووي الريبي.
          1. عينة الحمض النووي الريبي العازلة (500 ميكرولتر ، وجعل الطازجة).
            1. الجمع بين اجتماعات الأطراف 10X 50 ميكرولتر ، 250 formamide ميكرولتر ، 90 ميكرولتر الفورمالديهايد بنسبة 37 ٪ ، 108 ميكرولتر RF H ​​2 O و 2 بروميد إيثيديوم ميكرولتر (الأسهم حل 10 ملغ / مل).
          2. ل10-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، إضافة مضاعفة حجمه باستخدام عينة العازلة ، وذلك لتخفيف من ثلاثة أضعاف.
          3. تفسد على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم البرد على الجليد لمدة 5 دقائق.
          4. تدور رiefly وتحميل نموذج كامل في الآبار الى جانب السلم الحمض النووي الريبي (إضافة صبغة التحميل إذا رغبت في ذلك).
        4. Electrophorese
          1. ملء الغرفة العازلة مع اجتماعات الأطراف 1X.
          2. هاجروا في Electrophorese 50-75 فولت حتى علامات حول طول من هلام 2/3rd.
        5. تصور الجل على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.
          1. تحقق من وجود 18S 28S الريباسي حادة وعصابات الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) ، وأن الفرقة ضعف 28S مكثفة مثل الفرقة 18S (الشكل 4).
          2. والحمض النووي الريبي المتدهورة لها مظهر طخت ، والعصابات غامض ، أو لا يحمل نسبة 2:1.
    6. عادة ما نستخدم الكثافة البصرية لتقييم جودة مجموع الحمض النووي الريبي.
      1. وإن لم تكن حساسة مثل ، القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية من خلال Nanodrop هو وسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة من فحص الحمض النووي الريبي الجودة.
      2. ابحث عن الكثافة الضوئية (OD) 260/280 نسبة 1،5-2،0.
      3. نضع في اعتبارنا أن الحل الذي هو معلق في الحمض النووي الريبي (TE العازلة مقابل الماء) سوف تؤثر على نسبة OD.
  5. أنشطة PCR.
    1. قبل الإعداد PCR
      1. تصميم الاشعال محددة
        1. باستخدام Primerblast NCBI في http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. أدخل رقم الجينات المستهدفة الانضمام Refseq.
          2. تحديد حجم المنتج PCR من 7-20 سنة مضت.
          3. تعيين تيم من 55-72 درجة مئوية ، مع الفارق اقل من 5 ° الاشعال بين الأمام والعكس.
          4. حدد "التمهيدي يجب أن تمتد على مفترق اكسون - اكسون" للحد من الخلفية الجيني.
          5. تمكين تحقق خصوصية لقاعدة الجرذ RNA Refseq لضمان الاشعال لا تعترف أهداف إضافية.
          6. اختيار الزوج التمهيدي من النتائج التي تتناسب مع المعايير التالية :
            1. 18-30 قواعد طويلة.
            2. أقل من 2000 أسس بصرف النظر عن القالب.
            3. 40-60 ٪ ، جوانين سيتوزين محتوى الملزمة لضمان استقرار التمهيدي إلى القالب.
      2. اختيار الجينات المرجعية.
        1. وليس كل الجينات مرجعية تكون مناسبة لاقامة التجريبية الخاصة بك. في كل مرة يتم استخدام النموذج الجديد ، ينبغي التحقق من استقرار رجوع اليها. من أجل التناسق ، اخترنا لاستخدام واحد من الجينات المرجعية four المقدمة بشأن مجموعة RT PCR 2 التعريف.
        2. وينبغي أن يكون الجين إشارة جيدة تفي بالمعايير التالية :
          1. لا تغيير في مستوى التعبير عن النموذج التجريبي.
          2. غير أنها أعربت عن مستويات مماثلة لتلك التي من الجين المستهدف.
        3. لتحديد مرجعية مناسبة :
          1. مراجعة الأدبيات لتحديد المرشحين حظا لجين مرجعية مستقرة في النظام الخاص بك. على سبيل المثال ، نحن اختبار Rpl13a لأنه ثبت أن تكون مستقرة في دراسة نقص التروية. 11،12
          2. الاشعال التصميم كما نوقش أعلاه (أو العثور الاشعال بالفعل التحقق من صحة لجينات مرجعية مشتركة في قاعدة بيانات مثل RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. جنبا إلى جنب مع تحسين الاشعال الاشعال الجينات المستهدفة (أنظر أدناه).
          4. تحديد المرجعية المرشحة هي الأكثر استقرارا باستخدام برنامج مثل Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) الذي يحسب قيمة الاستقرار لكل الجينات على أساس الفرق intragroup وتحديد الجينات (s) مع أقل التعبير الاختلاف على العينات. على سبيل المثال ، هو جين Rpl13a المرجعية المثلى لأغراض التنمية المستدامة (الشكل 4).
      3. تحسين الاشعال.
        1. للحصول على نتائج متسقة وموثوق بها من qPCR والشعائل ولتلبية معايير معينة لل، خصوصية وحساسية استنساخ.
          1. فمن الأفضل لاختبار هذه المعلمات لكل زوج التمهيدي الجديد.
          2. يتم اختبار للاستنساخ عن طريق تشغيل تقنية متماثلة.
          3. ويمكن تقييم الأداء مع الحساسية من خلال منحنى مستوى التخفيفات 4 مرات متتالية.
          4. يتم تحديد النوعية التي تؤكد على منتج واحد عن طريق التحليل الكهربائي ومنحنى ذوبان هلام (الشكل 5).
        2. تشغيل لوحة qPCR لاختبار نوعية الاشعال الخاص ، وتركيز الاشعال لاستخدامه.
          1. [كدنا] توليفها من استخدام كامل الدماغ الحمض النووي الريبي ، وخلق منحنى القياسية (سلسلة من التخفيفات 4 مرات متتالية) على النحو التالي : 1 ، 1:4 ، 1:16 ، 1:64 ، 1:256 ، وعدم التحكم القالب (NTC) .
          2. لكل تمييع ، تشغيل 1 ميكرولتر [كدنا] في duplicaالشركة المصرية للاتصالات لكل تركيز الاشعال ، (أي 100 نانومتر ، 200 نانومتر و 300 نانومتر).
        3. يكرر تأكيد أن التقنية تعطي القيم متسقة ط.
        4. دراسة القيم ط م للمنحنى التخفيف.
          1. مؤامرة ضد القيم ط تركيز لكل من التخفيفات. وينبغي أن يترتب على الرسم البياني الخطي مع معامل الارتباط جيدة (أي> 0.95).
        5. دراسة منحنى تذوب لتأكيد وجود منتج التضخيم واحد (أي ذروة واحدة).
          1. إذا كان هناك قمم متعددة ، أو قمم ليست متشابهة ، وهذا قد يوحي التلوث ، mispriming ، التمهيدي ، ديمر قطعة أثرية ، وما إلى ذلك (الشكل 5).
          2. وسوف تصل إلى ذروتها في NTC المرجح أن تتوافق dimers التمهيدي والتي تشكل أكثر سهولة في ظل غياب قالب [كدنا] ، وينبغي أن لا تكون مصدرا للقلق.
        6. تأكيد ذوبان منحنى البيانات عن طريق حل المنتجات تضخيمها على agarose هلام 1 ٪.
          1. إعداد 1 ٪ agarose هلام (للاطلاع على حجم 100 مل)
            1. يزن 1 غرام من أصل agarose في دورق.
            2. إضافة 100 مل من خلات 1X - تريس العازلة (تاي) EDTA والميكروويف حتى يذوب agarose والحل واضح.
              1. 1 لتر 50x تاي العازلة يتكون من قاعدة تريس 2 م و 57 مل من حامض الخليك الجليدي ، و 0.05 M EDTA (8.0 درجة الحموضة).
              2. TAE عازلة لتمييع 1X بالماء المقطر (تركيزات النهائي : 40 مم ، تريس اسيتات EDTA و 1.0 ملم).
            3. السماح لتبريد هلام إلى 55 درجة مئوية قبل إضافة بروميد إيثيديوم إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل.
            4. صب صب جل في علبة والسماح لها لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.
          2. لتشغيل ، هلام مكان في غرفة مليئة الكهربائي 1X TAE ، والجمع بين ميكرولتر من 10 عينة من لوحة qPCR مع 2 ميكرولتر صبغة تحميل 6X ، تخلط جيدا وتحميله إلى جانب الآبار سلم الوزن الجزيئي.
          3. Electrophorese 50-150 فولت حتى في علامات هاجروا مسافة مناسبة ، اعتمادا على الحجم المتوقع من المنتج الخاص بك [كدنا].
          4. تصور مع transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.
          5. تأكد من أن المنتج هو من PCR تضخيم الحجم المناسب للهدف.
          6. وسوف يكون dimers التمهيدي حوالي 50 سنة مضت.
    2. قبل الشاشة لزيادة TNF - α.
      1. منذ TNF - α يبدأ تفاعلات الالتهاب في المحيط ، ونحن نشتبه في أن هذا ينطبق أيضا على الدماغ واستخدام الفحص الأولي لTNF - α مرنا كعلامة للشريحة مركز الثقافة المناعي (أي ، عادية ، صورية ، والمجموعات التجريبية) قبل الشروع لمجموعة كاملة تحليلات PCR.
      2. إذا العادية ومستويات الرقابة الصورية مرنا TNF - α ليست ضمن نطاق interassay وجدت داخل المختبر لدينا ، والتجارب (على سبيل المثال ، عادي ، صورية ، والمجموعات التجريبية) يتم التخلص منها وعدم الشروع في تحليل كامل مجموعة PCR.
      3. iScript التوليف [كدنا].
        1. لكل عينة الحمض النووي الريبي ، والجمع بين ما يلي في أنبوب PCR : 4 ميكروليتر مزيج التفاعل 5X ، 1 ميكرولتر الناسخ العكسي ، 25 نانوغرام RNA ، والترددات اللاسلكية H 2 O إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
        2. المزيج بلطف pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
        3. احتضان : 25 درجة مئوية ، 5 دقائق و 42 درجة مئوية ، و 30 دقيقة و 85 درجة مئوية ، 5 دقائق.
        4. تمييع 01:04 (إضافة 60 ميكرولتر المياه مجانا ريبونوكلياز).
        5. تخزين -20 درجة مئوية في الحفاظ على الجليد أو حتى جاهزة للاستخدام في غضون ساعات.
      4. qPCR عن TNF - α.
        1. تحضير مزيج الرئيسي لكل زوج التمهيدي.
          1. الجمع بين 12.5 ميكرولتر قريش SYBR الخضراء (1) ، مزيج التمهيدي ميكرولتر و 10.5 ميكرولتر المياه في العينة.
          2. لدينا كل من Rpl13a والاشعال TNF - α ، 200 نانومتر هو تركيز الأمثل.
          3. ضبط كمية من أجهزة الاشعال وحجم المبذر حسب الضرورة في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge RF والحفاظ على الجليد بينما تقوم بإعداد طبق من ذهب.
        2. إعداد لوحة التحكم مع qPCR / شمس / experimentals. استخدم 1 ميكرولتر من العينة في [كدنا] في نسختين عن كل الجينات.
        3. إضافة 24 ميكرولتر من مزيج لسيدك كل بئر وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج.
        4. نكون حذرين للغاية لتجنب الفقاعات ، لأنها سوف تتداخل مع قراءات مضان.
        5. تشغيل 40 دورات PCR التضخيم :
          1. 95 درجة مئوية ، 8.5min ؛
          2. 40 دورة : 95 درجة مئوية و 10 ثانية و 60 درجة مئوية ، و 30 ثانية و 72 درجة مئوية ، و 20 ثانية / دورة.
          3. تذوب منحنى : 55 درجة مئوية ، 1 دقيقة و 80 دورات من 0.5 درجة مئوية بزيادة 10 ثانية عن كل ابتداء من الساعة 55 درجة مئوية.
      5. تحليل البيانات (ΔΔCt الأسلوب ؛ الشكل رقم 4). 13
  6. [كدنا] تجميع للصفائف PCR.
    1. حساب الحجم (ميكرولتر) لكل عينة لدينا 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي.
      1. اختيار مبلغ من الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام إلى 1 ميكروغرام) التي يمكنك استخراج باستمرار من العينات الخاصة بك.
    2. RT 2 كيت ستراند الأولى -- حسب تعليمات الشركة الصانعة. باختصار :
      1. ذوبان الجليد وتدور أسفل كل الكواشف.
      2. لكل عينة الحمض النووي الريبي ، والجمع بين ما يلي في أنبوب PCR :
        1. 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي ، 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي 5X (gDNA) عازلة القضاء والماء إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر.
      3. المزيج بلطف pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
      4. احتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      5. البرد على الجليد لمدة 1 دقيقة.
      6. في الوقت نفسه ، وإعداد النسخ العكسي (RT) كوكتيل (في العينة) :
        1. الجمع بين 4 ميكرولتر من العازلة RT 5X 3 ، 1 ميكرولتر التمهيدي والخارجية مزيج مراقبة ، 1 ميكرولتر مزيج إنزيم RT 3 ، و 3 ميكرولتر من الماء.
      7. أضف 10 ميكرولتر من الكوكتيل RT لكل عينة والمزيج بلطف.
      8. احتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      9. وقف رد فعل من جانب تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      10. إضافة 91 ميكرولتر من 2 O H RF لكل 20 ميكرولتر رد فعل التوليف [كدنا] (مخفف إلى الحجم النهائي من 111 ميكرولتر).
      11. مزيج جيد من قبل pipetting.
      12. تخزين -20 درجة مئوية في الحفاظ على الجليد أو حتى جاهزة للاستخدام في غضون ساعات.
  7. 2 RT PCR مجموعة التعريف.
    1. اتبع التعليمات التالية لتلك الشركة المصنعة ويتم التأكيد هنا للراحة.
    2. إعداد الكواشف
      1. ذوبان الجليد وتدور أسفل كل الكواشف.
      2. تحضير الكوكتيل التجريبية :
        1. الجمع بين 1350 ميكرولتر من RT 2X SABiosciences 2 qPCR SYBR ميكس ماجستير الأخضر ، و 102 ميكرولتر من [كدنا] المخفف و 1248 ميكرولتر من 2 O H RF إلى الحجم النهائي من 2700 ميكرولتر.
      3. إزالة بعناية مجموعة من PCR كيس مختوم.
      4. الاستغناء الكوكتيل في خزان التحميل.
      5. إضافة إلى كل 25 ميكرولتر جيدا مع pipettor متعدد القنوات.
      6. بعناية مجموعة PCR ختم اللوحة.
      7. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      8. مكان حتى على الجليد برنامج PCR جاهزة.
    3. تشغيل البرنامج المناسب لركوب الدراجات جهازك.
      1. iCycler :
        1. 95 درجة مئوية و 10 دقيقة
        2. 40 دورة : 95 درجة مئوية و 15 ثانية و 60 درجة مئوية ، 1 دقيقة.
        3. تذوب منحنى : 55 درجة مئوية ، 1 دقيقة و 80 دورات من 0.5 درجة مئوية بزيادة 10 ثانية عن كل ابتداء من الساعة 55 درجة مئوية
    4. تحليل البيانات.
      1. حدد "تلقائي المحسوبة" لدورات الأساس.
      2. حدد "معرف المستخدم" لموقف العتبة يدويا تعيين قيمة العتبة.
        1. في "عرض السجل" ، تعيين العتبة في الثلث السفلي من المرحلة خطية من مؤامرة التضخيم.
        2. تأكد من إبقاء قيمة العتبة نفسها عبر تشغيله.
      3. تصدير البيانات.
      4. مدخلات ملف إكسل.
      5. تحميل لصفيف SABiosciences PCR تحليل البيانات.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. تحديد جينات مرجعية -- كنا Rpl13a.
      6. ممارستنا هو :
        1. تأكيد النتائج مع ما لا يقل عن مجموعة PCR مكررة.
        2. التغييرات مجموعة 3 أضعاف ليس من الضروري أن أكده لاحقا محددة الهدف PCR التضخيم. 6،7
        3. ينبغي تأكيد التغييرات أقل من 3 أضعاف لاحقة محددة الهدف PCR التضخيم أو استخدام صفائف PCR 2-3 (2X لتأكيد التغييرات.
    5. ويستخدم الحمض النووي قبل التضخيم لتحليل الاهداف مع التعبير منخفضة للغاية المتوقع (الشكل 6).
      1. والمقصود من SABiosciences RT 2 نانو PreAMP عدة توليف [كدنا] ويمزج التمهيدي لتضخيم المسبق من الحمض النووي الريبي للسماح استخدام كميات صغيرة (100-100 نانوغرام) عينة من الحمض النووي الريبي لتشغيل مجموعة كاملة PCR.
      2. كل مزيج التمهيدي يسمح للالتضخيم من 89 جينة محددة الهدف القوالب [كدنا] مع الحد الأدنى من التحيز. وقد استخدمنا هذا النظام كوسيلة لتضخيم الاشارات مستوى منخفض مثل الإنترفيرون λ الى مستوى اكتشافها.
      3. RT 2 نانو PreAMP عدة توليف [كدنا] -- حسب تعليمات الشركة الصانعة. باختصار :
        1. ذوبان الجليد وتدور أسفل كل الكواشف.
        2. لكل عينة الحمض النووي الريبي ، والجمع بين ما يلي في أنبوب PCR.
          1. 1 - 100ng من الحمض النووي الريبي ، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت gDNA القضاء 5x والماء إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر.
        3. المزيج بلطف pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
        4. احتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        5. البرد على الجليد لمدة 1 دقيقة. في غضون ذلك ، وإعداد الكوكتيل RT (في العينة).
          1. الجمع بين 4 ميكرولتر من العازلة RT 5X 3 ، 1 ميكرولتر التمهيدي والخارجية مزيج مراقبة ، 1 ميكرولتر التوليف انزيم مزيج [كدنا] (1) ، مثبط ريبونوكلياز ميكرولتر ، و 3 ميكرولتر من الماء.
        6. أضف 10 ميكرولتر من الكوكتيل RT لكل عينة والمزيج بلطف.
        7. احتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
        8. وقف رد فعل من جانب تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        9. تخزين -20 درجة مئوية في الحفاظ على الجليد أو حتى جاهزة للاستخدام.
      4. [كدنا] تضخيم مع الاشعال محددة.
        1. مزيج التالية في أنبوب PCR :
          1. 12.5 ميكرولتر مزيج الرئيسي PCR ، 7.5 ميكرولتر الاشعال محددة ، و 5 ميكرولتر من [كدنا] مخفف.
        2. تشغيل 12 دورات من التضخيم PCR.
          1. 95 درجة مئوية و 10 دقيقة.
          2. 12 دورات : 95 درجة مئوية و 15 ثانية و 60 درجة مئوية ، 2 دقيقة.
          3. عقد في 4 درجات مئوية.
        3. إضافة 2 رد فعل الجانب ميكرولتر المخفض على كل عينة.
        4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
        5. وقف رد فعل من جانب تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        6. 84 إضافة المياه إلى كل ميكرولتر RF 27 ميكرولتر رد فعل التضخيم [كدنا].
      5. تخزين -20 درجة مئوية في الحفاظ على الجليد أو حتى جاهزة للاستخدام في غضون ساعات.
      6. تضخيم الأهداف الفردية باستخدام الجينات الديوان الاشعال وSYBR مزيج سيد الأخضر كما هو موضح أعلاه.

4. فحوصات بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين المضاعفة للاشارة سايتوكاين

  1. تستخدم فحوصات لتحديد بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين Mutliplexed خلوى يجند مستقبلات الإشارات المصب (الشكل 7).
  2. تحديد كمية البروتين الكلي في الثقافات شريحة.
    1. حصاد الثقافات شريحة من خلال رفع بلطف شرائح الخروج من يدرج في مكان بارد ومل 1 (4 درجات مئوية) في برنامج تلفزيوني.
    2. أنابيب الطرد المركزي و 30 ثانية وPBS إزالته. مكان على الثلج الجاف حتى انتهاء الحصاد.
    3. المحل في -80 درجة مئوية.
  3. التجانس الثقافات شريحة لفحص البروتين الكلي.
    1. تعد الخلية تحلل العازلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني حاجة إلى إجمالي حجم المخزن المؤقت إلى مكان لا يقل عن 200 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل شريحة الثقافة.
        1. على سبيل المثال : إضافة 20 ميكرولتر من عامل 1 ، 10 ميكرولتر من عامل 2 ، و 20 ميكرولتر من PMSF 500 مم في DMSO الى 4.95 مل تحلل الخلية العازلة.
    2. ذوبان الثقافات في 200 شريحة عازلة تحلل ميكرولتر على الجليد.
    3. يصوتن الثقافات شريحة خمس مرات في ثانية (1) والبقول مكان يعود فورا على الجليد.
    4. دوامة عينات ل10 ثانية.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 4 عينات لمدة 15 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة درجة مئوية.
    6. طاف لنقل أنبوب نظيفة والحفاظ على الجليد.
  4. إجراء فحص البروتين الكلي.
    1. إعداد معايير البروتين.
      1. إعادة المخزون البقري ألبومين المصل (BSA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. إعداد معايير تتراوح 0-1000 ميكروغرام / مل المخفف في الماء عالية النقاوة لفحص البروتين BCA.
    2. هناك حاجة إلى حساب حجم كاشف العمل على عدد من العينات ومتماثلة.
      1. على سبيل المثال : (8 معايير + 18 عينات غير معروفة) × (2 مكررات لكل عينة) × (0.2 مل من كاشف العمل المطلوبة لكل بئر) = 10.4 مل مجموع حجم جميع العينات اللازمة لتحميلها على microplate.
        1. الجولة تصل إلى 12 مل الحجم الكلي لضمان حجم كاف.
      2. عندما خلط الكاشف A B مع كاشف الكاشف للعمل ، قد تحدث بعض التعكر ، ولكن ينبغي أن تختفي قريبا.
    3. تحميل 10 ميكرولتر من العينات والمعايير لكل بئر.
    4. تحميل 0.2 مل من كاشف العمل في الآبار.
    5. لوحة الغلاف مع ختم الشريط ويهز لمدة 30 ثانية إلى المزيج.
    6. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. طبق بارد لدرجة حرارة الغرفة (حوالي 10 دقيقة) قبل القراءة على قارئ لوحة في الطول الموجي 595 نانومتر.
    7. بناء المنحنى القياسي باستخدام Microsoft Excel مع قياس الامتصاصية مقابل التركيز المتوقع.
      1. ومعامل الارتباط الجيد يساوي أو أكبر من 0.98.
    8. حساب تركيزات البروتين في عينات باستخدام المعادلة الخطية المستمدة من المنحنى القياسي.
    9. تمييع تحلل العينات في المخزن لكميات متساوية من البروتين وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لمزيد من المعالجة.
    10. وينبغي تركيز البروتين نطاق 200-900 ميكروغرام / مل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. إجراء الفحص ملتيبليكس.
    1. ملاحظة : المقايسات بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين المضاعفة تأخذ 2 مجموع أيام كاملة ، مع 1 ساعة الأولي انشاء وتحميل لوحة يعقبه incu بين عشية وضحاهاخطوة إضافية bation والحضانة وغسل الخطوات في اليوم التالي.
    2. رسم خريطة للآبار الذي سيحتوي التي lysate وفق ورقة عمل في الدليل.
    3. أذاب عينات الأنسجة والمتجانس lysates عدة في درجة حرارة الغرفة ثم ضع على الجليد. إحضار جميع المخازن والكواشف المنصوص عليها في عدة إلى درجة حرارة الغرفة (باستثناء streptavidin والخرز).
    4. حبات لإعداد مقايسة متعددة.
      1. تغطية الأنابيب التي تحتوي على حبات مقرونا رقائق الألمنيوم للحماية من الضوء. دوامة الأنابيب لمدة 5 ثوانى والحفاظ على الجليد.
      2. تمييع الخرز يقترن 01:50 العازلة في غسل.
        1. وينبغي أن تحتوي على كل بئر 1 ميكرولتر من الخرز يقترن في 49 العازلة غسل ميكرولتر عن حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر لكل بئر.
    5. معايرة جهاز فراغ.
      1. يغسل مع 100 لوحة العازلة يغسل جيدا لكل ميكرولتر.
      2. بدوره على الفراغ وشفط السوائل الزائدة خارج أي إطار 2-5 ثوانى.
        1. إذا الإزالة الكاملة للالعازلة وقتا أطول أو أقصر من 2-5 ثانية ، ضبط صمام الضغط تبعا لذلك.
        2. جفاف الجزء السفلي من اللوحة بدقة قبل ان يضيف العينات.
    6. دوامة حبات المخفف لمدة 5 ثوانى جانب وإضافة 50 ميكرولتر من الآبار المعينة.
      1. وعلى الفور تصفية فراغ الجافة الجزء السفلي من اللوحة مع منشفة ورقية.
    7. غسل لوحة مرتين مع 100 العازلة يغسل جيدا لكل ميكرولتر. جفاف الجزء السفلي من لوحة بعد كل غسل.
    8. دوامة إذابة العينات لمدة 3 ثوانى وإضافة 50 ميكرولتر من الآبار المعينة. ختم الشريط أكثر من مكان واحتضان لوحة 15-18 ساعة تهتز في 300 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ومحمية من الضوء.
    9. فراغ السائل الزائد وتصفية لوحة يغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر غسل العازلة. جفاف الجزء السفلي من لوحة بعد كل غسل.
    10. تمييع 01:25 الأضداد في الكشف عن غسل العازلة.
      1. كل بئر يتطلب الكشف عن الأجسام المضادة 1 ميكرولتر في الحجم الكلي للغسل ميكرولتر 25 العازلة.
    11. مكان الشريط ختم على لوحة وحمايتها من الضوء بورق الألمنيوم. يهز لمدة 30 ثانية ، وزيادة السرعة تدريجيا إلى 1100 دورة في الدقيقة. تواصل تهتز في 300 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    12. فراغ فلتر لوحة ويغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر غسل العازلة. جفاف الجزء السفلي من لوحة بعد كل غسل.
    13. وفي الوقت نفسه حماية لوحة من الضوء ، وإعداد التخفيف من 1:100 streptavidin - PE مع حجم ما يكفي لإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر. حماية الحل بعيدا عن الضوء.
    14. دوامة جيدا وإضافة 50 ميكرولتر المخفف streptavidin - PE لكل بئر. احتضان مع اهتزاز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية بعد 10 دقيقة من قبل في 300 دورة في الدقيقة.
      1. العازلة الفراغ الزائدة تصفية الخروج.
      2. غسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر العازلة إعادة تعليق لكل بئر.
      3. جفاف الجزء السفلي من لوحة جيدا بعد كل غسل.
    15. إضافة 125 ميكرولتر العازلة إعادة تعليق كل ويهز جيدا لمدة 30 ثانية في 1100 دورة في الدقيقة.
    16. قراءة لوحة فورا أو تخزينها في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء لمدة تصل إلى 24 ساعة.

5. محاكاة والتحوير في اشارة سايتوكاين

  1. وتستخدم بروتينات خلوى المؤتلف (مع الناقل) لمحاكاة التغيرات في SD.
    1. يتم تخزين البروتينات مجفف بالتجميد (مثلا ، TNF - α) لمدة تصل إلى 1 في السنة -20 درجة مئوية.
    2. بعد التوصل إلى حل تمييع الأسهم مع المصل البقري aliquots 0.1 ٪ ، وتعد الزلال ، وتخزينها في -20 درجة مئوية ، وحتى استخدام في غضون 3 أشهر.
    3. يتم تحديث أي تلاعب على الثقافات شريحة على الأقل كل يوم الثالث على التوالي.
  2. وتصمت إشارات خلوى من قبل :
    1. استخدام إشارات خلوى التقليدية وكلاء تتالي الدوائية ؛
    2. استخدام مضادات للذوبان يجند [مثل مستقبلات TNF ذوبان 1 (كما هو موضح أعلاه ليغاندس المؤتلف)] ؛ أو
    3. إسكات الجينات [أي الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا)].
  3. تسليم سيرنا إلى الخلايا العصبية في كثير من الأحيان مشاكل.
    1. المشترك القائم على الكواشف الدهون عادة نتيجة انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن وفقدان قابلية الخلية.
    2. بدلا من ذلك ، ونحن نستخدم الحرارية العلمية Dharmacon siRNAs Accell ، والتي تسمح لضربة قاضية كفاءة عالية دون استخدام كاشف ترنسفكأيشن.
    3. هنا نعرض ضربة قاضية باء cyclophilin ، وهو بروتين غير الضرورية التي أعرب عنها في جميع أنواع الخلايا ، والتأكيد على استخدام هذا الأسلوب في الثقافات شريحة.
    4. تم تكييفها لبروتوكول توصيل الثقافات شريحة من الشركة الصانعة للاستخدام في الخلايا الملتصقة.
      1. تمييع 5X العازلة سيرنا إلى 1X بالماء ريبونوكلياز الحرة.
      2. يعد حل سيرنا في 100μM 1X العازلة
        1. وتقدم Cyclophilin B سيرنا في 5 nmol. Resuspend في 50 ميكرولتر من 1X العازلة للسهم 100 ميكرومتر.
      3. سيرنا مع مزيج Accell التسليم mediuم إلى التركيز النهائي للسيرنا 1μM.
        1. إضافة 11 ميكرولتر من 100 ميكرومتر سيرنا الأسهم إلى 1100 ميكرولتر المتوسطة تسليم Accell في صفيحة 6 - جيدا.
        2. مكان في الحاضنة ، والسماح للتوازن درجة الحرارة في ظروف طبيعية لاحتضان ما لا يقل عن 20 دقيقة.
      4. باستخدام غطاء BSL - 2 وتقنية معقمة ، وتدرج في مزيج نقل المحتوية على تسليم الآبار.
        1. احتضان مع المزيج لمدة 96 ساعة تسليم ضربة قاضية للبروتين.
          1. تقييم ضربة قاضية البروتين لطخة غربية أو تكثيفها immunostaining.
          2. البقع الغربي ، في حين أن احتمال اختيار أول ضربة قاضية الكفاءة ، قد تكون حساسة جدا لمستوى منخفض مما يشير المناعية المرتبطة بظاهرة غير الضارة من SD.
          3. تبعا لذلك ، لقد تابعنا السلبية القياسات طخة الغربية مع تعزيز الفضة immunostaining (DAB) وقياسات كثافة diaminobenzidine القائم على الحاسوب (أنظر أدناه).

6. البروتين المصادقات

  1. يتم تأسيس خلية من التغييرات النوعية باستخدام بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين immunostaining. 6،7
    1. الإصلاح الثقافات شريحة لمدة 24 ساعة مع تثبيتي PLP تتكون من :
      1. 10 مل بارافورمالدهيد 16 ٪ ، ز 1.096 ليسين ، 0.42 غ فوسفات الصوديوم ، والصوديوم بريودات 0.17 غرام ، شغل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 80 مل من الماء عالى النقاء (6.2 درجة الحموضة وتثبيتي).
      2. بعد 24 ساعة ، وإزالة بلطف الثقافات شريحة من إدراج بفرشاة غرامة ونقل إلى أزيد الصوديوم التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (100 ملغم / لتر) حتى جاهزة للمقطع.
      3. ثم احتضان شرائح لا يقل عن 24 ساعة في PBS - 20 ٪ سكروز ، وقطع شريحة الثقافات كلها إلى أقسام ميكرومتر 20 ، وجبل لشرائح هلام المغلفة.
      4. ويتم إنجاز immunostaining فلوري (على سبيل المثال ، لNFκB) على النحو التالي مع جميع الخطوات بالإضافة إلى اهتزاز في الدقيقة 50 ~.
        1. تغسل شريحة الثقافات في 3 مرات مل three PBS لمدة 10 دقيقة.
          1. شنت الشرائح مكان الثقافات مع 20 شريحة ميكرون في الجرار مع ~ Coplin PBS مل 40 ليغسل كل الخطوات.
        2. تغسل شريحة الثقافات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 دقيقة لكل يغسل.
        3. وضع قطرات قليلة من SFX إشارة محسن على الثقافات واحتضان شريحة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة.
        4. احتضان الثقافات شريحة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية مع الأضداد المضادة للأرنب في NFκβ 1:100 مخففة في تريتون 0.75 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني.
          1. ماصة حل الضد مباشرة على شرائح.
        5. إزالة شرائح من حل الأضداد ويغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل يغسل.
        6. احتضان شرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في مكافحة الأرانب الماعز الضد AlexaFluor 594 فى الساعة 1:50 من 0.75 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني.
          1. الطرد المركزي AlexaFluor 594 الضد لمدة 15 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة لإزالة أي التي قد تعجل في حل المشكلة.
        7. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 دقيقة لكل يغسل.
        8. تراجع الشرائح في الماء المقطر لشطف أي الأملاح من برنامج تلفزيوني.
        9. ساترة مع إطالة متوسط ​​antifade والسماح لالجاف لا يقل عن 2 ساعة ، مغطاة بعيدا عن الضوء.
        10. تصور مع المجهري (الشكل 7) التقليدية أو مبائر مضان.
  2. يمكن أن تكون التغييرات إنتاج البروتين من ضربة قاضية سيرنا المقررة بحساسية من خلال تعزيز DAB التقليدية immunostaining 7 عن طريق تكثيف 16 فضية وتقدير الكثافة اللاحقة (على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا لcyclophilin B) (فيديو الشكل 2).
    1. Immunostaining ل B cyclophilin يلي إجراءات موحدة لحقل التصوير مشرق لنا تفصيلا في الآونة الأخيرة ، 7 باستخدام :
      1. مكافحة فأر cyclophilin B (1:100) لمدة 24 ساعة على 4 درجات مئوية ؛
      2. يليه وضع العلامات الفجل البيروكسيداز الضد الثانوية (1:100) ؛
      3. وDAB التصور.
    2. و ردود الفعل DAB وخافت جدا للسماح quantification17 الكثافة الرقمية ، يمكن تكثيف أنها مع إجراء الفضة متفاوتة وفقا لكوين وGraybiel (16).
      1. ترطيب الشرائح ثم يغسل جيدا × 3 لمدة 10 دقيقة في المياه عالية النقاء.
      2. الشرائح مكان في المياه عالية النقاء في جرة Coplin ودافئة ل56 درجة مئوية.
      3. إعداد نشادرية محلول نترات الفضة (0.5 ٪) :
        1. غير المخفف الطازج الأسهم كلوريد الأمونيوم (25-30 ٪) (1:1) مع الماء عالية النقاوة.
        2. إضافة هيدروكسيد الأمونيوم (~ 500-600 ميكرولتر لكل 100 مليلتر) قطرة قطرة مع التحريك إلى حل نترات الفضة بنسبة 0.5 ٪ وهذا بدوره سيؤدي لفترة وجيزة ثم غائما واضحة.
        3. الحل الدافئة إلى 56 درجة مئوية.
        4. احتضان لمدة 10-12 دقيقة المقاطع.
      4. تغسل الشرائح لمدة 15 ثانية في مياه عالية النقاء (يتم القيام بذلك وبجميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجرار Coplin).
      5. تراجع الشرائح لمدة 15 ثانية في ثيوسلفات الصوديوم 1 ٪ (pentahydrate).
      6. تراجع الشرائح لمدة 15 ثانية في مياه عالية النقاء.
      7. نغمة الشرائح لمدة 2 دقيقة في كلوريد الذهب بنسبة 0.2 ٪.
      8. تراجع الشرائح في المياه عالية النقاء لمدة 15 ثانية.
      9. كشف الشرائح للحمض الأكساليك بنسبة 0.5 ٪ لمدة 2 دقيقة.
      10. تراجع الشرائح لمدة 15 ثانية في مياه عالية النقاء.
      11. علاج الشرائح لمدة 5 دقائق في ثيوسلفات الصوديوم 5 ٪.
      12. تغسل الشرائح بدقة عالية في يذوى نقاء ، والمياه وساترة.
      13. الشرائح جاهزة الآن لتقدير الكثافة (17).
        1. يتم تشغيل جميع المعدات ، بما في ذلك مجال الإضاءة الساطعة ، على الأقل لمدة 20 دقيقة قبل التصوير.
        2. يتم تصويره بالكامل في المقاطع ثقافة شريحة 10X - 5 على مجهر مقلوب.
        3. يتم تعيين شدة الضوء إلى مستوى موحد (على سبيل المثال ، ~ 2.6 V) ، وليس تغيير في جميع عمليات الاستحواذ الصورة.
          1. وتستخدم مرشحات الكثافة محايدة حسب الحاجة للحد من نقل صورة كاملة لشدة الضوء ~ 1500 على نطاق 12 بت (0-4095) حيث "0" أسود تماما و4095 أبيض تماما.
        4. ثم يتم الحصول على الصور الرقمية وتخزينها إلكترونيا للجميع (أي مراقبة صورية والعينات التجريبية) ، بما في ذلك صورة خلفية مشتقة شكل مساحة الشريحة دون أقسام الثقافة شريحة.
        5. وطرح صورة الخلفية من جميع الصور (صورية والتجريبية) ، ومجال اهتمام (الهيئة) رسمها حول كل ثقافة شريحة وشدة الضوء المنقولة المسجلة.
        6. تم تعيين مجموعة كثافة صورة لمجموعة ثابتة لجميع التجارب.
        7. من أجل الوضوح ، كما أعرب الناتجة كثافة نسبية بالمقارنة مع مستويات الرقابة (الشكل 8).

7. ممثل النتائج :

الشكل 1
الشكل 1. المركز الأول هو ثقافة شريحة نموذج تسجيل الكهربية. microelectrode تسجيل في طبقة الخلايا العصبية الهرمية CA3 ومن ثم يتم وضع قطب كهربائي بين القطبين تحفيز في التلفيف المسنن (DG).

الشكل 2
الشكل 2. أثار CA3 امكانات الحقل والتي يسببها انتشار الاكتئاب synaptically. (A) تبدأ التجارب مع تحديد الحالية اللازمة لتعظيم معيار الحقل منطقة CA3 الردود المحتملة ثم يستخدم نصف الكثافة القصوى للحصول CA3 امكانات منطقة الميدان أثار. هذه الوثائق من الاستجابات الطبيعية بين متشابك أثارت الاستعدادات. إذا إمكانات شريحة الميداني آخر مثير متشابك لا يقل عن 3 بالسيارات ، يتم تجاهل شرائح (B) المقبل ، وعتبة عبر synaptically أثار لتحريك الاكتئاب ينتشر يتم تحديد (يمين ، واستجابات بطيئة) بينما في إمكانات الوقت نفس الحقل (إلى اليسار وتستخدم ، والاستجابات السريعة) للوثيقة أن الاستعدادات جيدة بما يكفي لمتابعة تنشيط 10 هرتز (على سبيل المثال ، سعة الانحرافات المحتملة الرأسي في السجلات بسرعة مماثلة).

الشكل 3
الشكل 3. الحركة دبقية المرتبطة انخفاض النشاط الإثبات. متشابك تبين أن فروع دبقية يمتد ويتقلص مع زيادة النشاط متشابك ، ولكن لمسافات طويلة حركة هذه الخلايا استجابة لنشاط متشابك لم يتم وصفها في الدماغ لم يصب بأذى. لدينا نتائج استخدام العلامات الفلورية isolectin B4 الخلايا الدبقية الصغيرة التي تظهر من جزء بسيط من هذه الخلايا تتحرك لمسافات طويلة في ظل ظروف طبيعية. علاوة على ذلك ، زيادة كبيرة في عدد من هذه الخلايا الدبقية الصغيرة السفر عندما يتم إلغاء النشاط متشابك من التعرض لثقافة سم الأسماك الرباعية الأسنان كما هو مبين في الصورة المرفقة. سافر مسارات خطوط حمراء علامة بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة خلال الفترة من 6 ساعات مع الأسهم الزرقاء بمناسبة منشأ الخلايا الدبقية الصغيرة المثالية a قليلة. شريط المعايرة ، 50 ميكرومتر.

الشكل 4
الشكل 4. PCR أنشطة الفرز. (A) ونحن نستخدم TRIzol جنبا إلى جنب مع مجموعات Qiagen لعزل الحمض النووي الريبي منذ ذلك الحين ، في أيدينا ، وهذا ينتج عنه أكبر بكثير (P <0.001 ؛ اختبار t). RNA العائد من ثقافات شريحة الحصين من استخدام مجموعات Qiagen وحده (B) في بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نؤكد أن إجراءاتنا دوري استخراج الحمض النووي الريبي RNA تنتج نوعية عالية سليمة كما هو محدد من خلال جل العصابات التي تظهر حادة الحمض النووي الريبي (C) ونحن نستخدم برامج NormFinder لاختيار مرجع الجين مع أفضل قيمة الاستقرار. على سبيل المثال ، تتعرض شريحة الثقافاتلlipopolyssacharide (100 نانوغرام / مل لمدة 2 ساعة) وجرى تحليل للجينات المرجعية الثلاثة (Rpl13a ، β - أكتين ، 18S). يتم استخدام القيم التصوير المقطعي لحساب قيمة الاستقرار. البيانات المتوفرة لدينا هنا [وذلك لتجارب أخرى باستخدام الاكتئاب ينتشر (لا تظهر البيانات)] تبين أن Rpl13a هو جين المرجعية المثلى. (D) ونحن استخدام "ΔΔCt" الأسلوب كوسيلة حساسة وقابلة للتكرار للكشف عن تغيير أضعاف الاختلافات بين المجموعات التجريبية RNA والضوابط صورية.

الشكل 5
الشكل 5. PCR يتحقق التفاعل. (A) ونحن قياس منحنى التكبير لتخفيف الاشعال كوسيلة للتحقق من نوعية ردود الفعل PCR. على سبيل المثال ، تظهر التكبير الأمثل موحد (1-5) زيادة في عتبات ط م (ب) وفي المقابل ، ليست موحدة التكبير مع الاشعال الفقراء (1-5) (C) وبالإضافة إلى ذلك ، نقوم منحنى تذوب في اختتام المقايسات PCR للتأكد من أن يتم الكشف عن amplicons المطلوب (أي ذروة منحنى واحد) ، مما يدل على عدم وجود أي الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل بما في ذلك dimers التمهيدي ، وتلويث الحمض النووي وmisannealed منتج PCR (التي من شأنها أن تظهر منحنيات الذروة متعددة).

الشكل 6
الشكل 6. نانو قبل التضخيم يسمح الكشف عن الإنترفيرون λ شريحة الحصين في الثقافات ، ومنذ وجدت فقط ~ 50 خلايا تي في ثقافة شريحة (من مجموع الخلايا ~ 55،000-90،000) ، استخدمنا 2 RT نانو PreAMP كيت التجميعي [كدنا] كما وسيلة للكشف عن إمكانات التعبير مستوى منخفض جدا من الإنترفيرون λ. قدمت هذه الوسيلة preamplification [كدنا] أي بزيادة 12 ضعفا في حساسية لمستويات الحمض النووي الريبي. النتائج المبينة أعلاه توضح قدرة preamplification لزيادة حساسية الكشف. وكان التصوير المقطعي عتبة كمرجع الجين Rpl13a 20.5 مع التضخيم الأولي وتمت زيادة هذا إلى 14.1 مع استخدام عدة preamplification ، أي بزيادة 12 أضعاف الموافق 12 دورات PCR التضخيم من [كدنا]. في موازاة ذلك ، كان الإنترفيرون λ لا يمكن كشفها (0.0) ولكنه كان جيدا في نطاق الكشف عن (29.0) مع preamplification.

الشكل 7
الشكل 7. بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين الفطرية مسار التغييرات خلوى الفسفرة. (أ) تأثير المثالي TNF - α المعالجة (أي العصبية) على الطريق الفطري خلوى الفسفرة بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين 24 ساعة بعد الاصابة excitotoxic في الثقافات شريحة الحصين. النتائج تظهر تغيرات المنطقة CA1 بين شرائح سابقة التجهيز لمدة 3 أيام مع 100 نانوغرام / مل TNF - α قبل التعرض لN - ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA) بالمقارنة مع أولئك الذين يتعرضون لNMDA وحده (أي التجريبية مقابل الشام) كنسبة النسبة المئوية. لاحظ أن TNF - α الناجم عن زيادة مستمرة في الفسفرة وATF JNK - 2 فضلا عن زيادة عابرة في NFκB (B) هو كشف التوزيع المكاني للتنشيط NFκB (أي وجود NFκB فسفرته في النواة) من قبل immunostaining ( الحمراء). يويو البقع الخضراء النوى في شريحة قسم الثقافة [على سبيل المثال ، في النجمية (السهم الرأس)]. العصبونات الهرمية ، التي على خلاف ذلك سوف تظهر أيضا أخضر ، أصفر وبدلا من ذلك بسبب ما يصاحب ذلك بمناسبة مع NFκB فسفرته (الحمراء). شريط المعايرة ، 25 ميكرومتر.

الشكل 8
الشكل 8. . تأكيد البروتين من الكفاءة سيرنا المتباينة تكثيف فضية البيروكسيداز diaminobenzidine immunostaining - B cyclophilin مقرها ليبين أن سيرنا يمكن بكثير (P <0.001 ؛ ANOVA - هولم - Sidak أسلوب) خفض العالمية الحصين التعبير شريحة B cyclophilin 3 أيام بعد تطبيق 500 ، 200 أو سيرنا 1000 نانومتر.

Discussion

SD هو اضطراب في الدماغ الانتيابي الخصائص هي التي تحفظ للغاية في جميع مناطق الدماغ فحص الأنواع وحتى الآن. تدرس عادة SD في القشرة المخية الحديثة. ومع ذلك ، فإن تعقيدات الدوائر العصبية لهذا الهيكل (مقارنة الحصين) ، فضلا عن عدم القدرة على الحفاظ على القشرة المخية الحديثة على قيد الحياة في المختبر مع وظائف جهاز المناعة هادئة لفترات طويلة ، وجعلها أقل فائدة باعتبارها استعدادا المختبر لتحديد الآثار طويلة الأمد SD من الحساسية. في المقابل ، ليس فقط الحصين بنية الدماغ التي هي الأكثر حساسية للSD ، وهو أيضا بنية archicortical مع هيكل الدوائر العصبية أكثر بساطة وظيفة ، والتي هي مناسبة تماما لتحديد الوسائل التي neuroimmune النشاط العصبي يمكن أن تعدل SD الحساسية .

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS - 19108) ، والمعهد الوطني لصحة الطفل والأمراض (PO1 - HD09402) ، ومؤسسة البحوث ومؤسسة الصداع النصفي الأبيض. السيدة مارسيا P. Kraig ساعد في إعداد وصيانة أنظمة الثقافة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium
Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium
Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes
Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup
Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest
Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction
Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification
Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening
Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling
Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry
Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. , (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6 (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. , (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 52 ، والحصانة الفطرية ، وإنهاض ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، وخلايا تي ، الحصين ، والثقافة ، شريحة ، التعبير الجيني ، ليزر تشريح المجهري ، qPCR في الوقت الحقيقي ، انترفيرون غاما
النمذجة اشارة المناعة العصبية من الصداع النصفي العرضية والاكتئاب المزمن عن طريق نشر<em> في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y.,… More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter