En omfattande översikt av de tekniker som är inblandade i att skapa en musmodell av cancer i munhålan och kvantitativ uppföljning av tumör invasion i tungan genom multi-foton mikroskopi av märkta celler presenteras. Detta system kan fungera som en användbar plattform för de molekylära bedömning och drog effekt av anti-invasiva föreningar.
Loco-regional invasionen av huvud-och halscancer är kopplat till metastaserande risk och innebär en svår utmaning att utforma och genomföra strategier för patienten. Orthotopic musmodeller för cancer i munhålan har utvecklats för att underlätta studier av faktorer som påverkar invasionen och tjäna som modell för utvärdering av anti-tumör terapi. I dessa system har visualisering av sprids tumör celler i munhålan vävnader vanligtvis gjorts av antingen konventionell histologi eller med in vivo självlysande metoder. En primär nackdel med dessa tekniker är den inneboende oförmåga att korrekt visualisera och kvantifiera tidiga tumörcellen invasion som härrör från den ursprungliga platsen i tre dimensioner. Här beskriver vi ett protokoll som kombinerar en etablerad modell för skivepitelcancer i tungan (SCOT) med två-photon imaging att tillåta flera vectorial visualisering av linguala tumören spridit sig. OSC-19 huvud och hals tumör cellinje var stabilt konstruerad för att uttrycka F-aktin bindande peptid LifeAct smält till mCherry fluorescerande protein (LifeAct-mCherry). Fox1 nu / nu möss injiceras med dessa celler bildar ett tillförlitligt tumörer som gör att tungan ska visualiseras genom ex vivo tillämpning av två-photon mikroskopi. Denna teknik gör det möjligt att orthotopic visualisering av tumören massa och lokalt invaderande celler i utskurna tungor utan avbrott i det regionala tumör mikromiljö. Dessutom kan detta system för kvantifiering av tumörcellen invasion genom att beräkna avstånd som invaderade celler flytta från den primära tumören platsen. Sammantaget detta förfarande ger en förbättrad modell för att analysera faktorer som bidrar till SCOT invasionen och terapeutiska behandlingar skräddarsys för att förhindra lokal invasion och fjärran metastasering. Denna metod har också potential att bli i slutändan kombineras med andra avbildningsmetoder i en in vivo miljö.
Orthotopic musmodeller har visat sig användbart för att studera många aspekter av huvud-och halscancer 1,2. Vi har kombinerat en väl etablerad orthotopic system av SCOT 3 med två-photon mikroskopi avbildning av mCherry-märkta celler som ett system för att studera de tidiga händelserna i huvud och hals tumörcellen invasion. I detta förfarande har vi noterat att celler kan läcka från platsen för tumören injektion, speciellt i möss sex veckor eller yngre på grund av otillräcklig tungan storlek. Vi använder äldre möss för att undvika detta problem. De större tungan storlek med äldre möss hjälper också till att undvika ruptur av en flerspråkig artär och överdrivna blödningar från tungan. Tumör ta förbättras avsevärt när tungan dramatiskt sväller på platsen för första injektionen. Denna svullnad avtar inom en tre dygn när den injicerade vätskan absorberas. Tumörtillväxt verkar uppenbart 1-2 veckor efter injektion med den injicerade anges antalet celler som en liten vit bula på tungan ytan. Vi noterar också att vid 40X objektiv som används i våra studier som presenteras här kan vi inte urskilja enskilda tumörceller men inte fastställer integrerade riktlinjerna som invasiv cell kluster som rekapitulera det typiska sättet att HNSCC invasion.
Hittills denna modell har i stor utsträckning används för att testa rollen av specifika molekyler samt flera anti-tumör läkemedel på SCOT tillväxten en invasion, med effekt mätt med livmoderhalscancer lymfa övervakas nod metastaser med IHC eller självlysande metoder 4-7. Tumörer som bildas i detta system manifestet nära tungan ytan (Figur 7), vilket gör att tillämpningen av två-photon mikroskopi för att bilden hela tumörer på plats som invasiv flercelliga kluster. Förfarandet kan också användas för att visualisera tumören invasionen med cellulära upplösning. Två-foton mikroskopi har tidigare utnyttjats för att studera experimentella behandlingar för huvud-och halscancer i orthotopic 8,9 och xenograft 8,10 modeller. Det finns dock två stora skillnader mellan dessa rapporter och våra protokoll. Först dessa studier använder extracellulära etiketter för att rikta / identifiera huvud och hals tumörceller, eventuellt begränsa upptäckt bara för att tumörceller med riklig tillgång till cirkulationen. För det andra invasion av tumörceller nära den primära platsen som sannolikt rekapitulerar tidigt metastaserande verksamheten inte bedömdes som en experimentell parameter. Vårt protokoll ger möjlighet att direkt kvantifiera tumörceller invasion när som helst under tumörprogression hos mus tungor. Medan den metod som beskrivs här beskrivs det förfarande med dissekeras tungor, vi är just nu i färd med att anpassa denna metod för att bilden tumör invasion i levande möss för användning i kombination med mareld att samtidigt övervaka tidiga invasion, lokala lymfknutor och fjärrmetastaser i samma djur. Ändringar till protokollet för in vivo-avbildning kräver utformning av en lämplig tidpunkt för placering och underhåll av möss under bildhantering, samt ett praktiskt system för att korrekt vattna munhålan på sövda möss under avbildning förfarandet. När optimerad, kommer dessa anpassningar ger möjlighet att studera vilken roll potentiella pro-invasiv molekyler och testa anti-invasiva föreningar på lokal invasion och mer avlägsna metastaser hos djur under längre tidsperioder.
The authors have nothing to disclose.
Med stöd av ett delprojekt av NIH bidraget P20 RR16440 och en bro bidrag från West Virginia University kontoret för forskning och forskarutbildning till S. Weed. Tekniskt stöd från L. Lopez-Skinner under de tidiga faserna av projektets utveckling är tacksamt erkänns. Författarna är också tacksamma för tekniskt bistånd och OSC19 celler från J. Myers och M. Younes (Institutionen för Head and Neck Surgery, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner och K. Secrest (West Virginia University Institutionen för patologi vävnadsbanken) för histologisk bearbetning och förfaranden, R. Wysolmerski (West Virginia University, Institutionen för neurobiologi och anatomi) för LifeAct-mCherry konstruera och J. Bear (University of North Carolina) för pLL7.0 Lentiviral vektor. Användningen av West Virginia University Mikroskopi Imaging Facility (med stöd av NIH bevilja P20 RR16440 och Mary Babb Randolph Cancer Center) och dess icke-linjär optisk mikroskopi laboratorium (NLOM, stöds av ett gemensamt samarbete mellan West Virginia University Center för neurovetenskap och West Virginia University Institutionen för fysik / West Virginia nanovetenskap Initiative) är också tacksamt. Den NLOM stöds delvis av NIH bidraget P30 RR031155 till Centrum för neurovetenskap.