Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Summary

סקירה מקיפה של טכניקות מעורב ביצירת מודל עכברי של סרטן הפה ניטור כמותי של הפלישה הגידול בתוך הלשון באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון של תאים שכותרתו מוצג. מערכת זו יכולה לשמש פלטפורמה שימושי להערכת יעילות התרופה מולקולרית של תרכובות אנטי פולשנית.

Abstract

לוקו אזורי הפלישה של סרטן הראש והצוואר קשורה לסיכון גרורתי מציב אתגר קשה בעיצוב ויישום אסטרטגיות ניהול המטופל. מודלים העכבר orthotopic של סרטן הפה פותחו כדי להקל על מחקר של גורמים הפלישה להשפיע ולשמש מודל להערכת מערכת אנטי הגידול הרפוי. במערכות אלה, ויזואליזציה של תאים סרטניים המופץ בתוך רקמות חלל הפה יש בדרך כלל נערכו על ידי היסטולוגיה או קונבנציונלי או עם שיטות vivo bioluminescent. החיסרון העיקרי של שיטות אלה הוא חוסר היכולת לחזות במדויק את הטמון ולכמת תא בתחילת הפלישה הגידול הנובע האתר הראשי בשלושה ממדים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשלבת מודל הוקמה עבור קרצינומה של תאים קשקשיים של הלשון (סקוטי) עם הדמיה שני הפוטונים כדי לאפשר רב וקטורי להדמיה של התפשטות הגידול לשוני. OSC-19 ראש הגידול בצוואר קו התא תוכנן ביציבות לבטא את LifeAct F-אקטין פפטיד מחייב התמזגו לחלבון mCherry ניאון (LifeAct-mCherry). Fox1 ^{נו / נו} עכברים הוזרקו תאים אלה בצורה אמינה גידולים המאפשרים הלשון להיות דמיינו ידי יישום לשעבר vivo של מיקרוסקופיה שני הפוטונים. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה orthotopic של מסת הגידול והמקומית פולשים לתאים לשונות נכרת ללא הפרעה של microenvironment הגידול האזורי. בנוסף, מערכת זו מאפשרת כימות של הפלישה תאים סרטניים על ידי חישוב מרחקים שפלשו להעביר תאים ממקום הגידול הראשוני. בסך הכל הליך זה מהווה מערכת מודל משופר לניתוח הגורמים שתורמים הפלישה Scot וטיפולים טיפולית המותאמת למנוע פלישה מקומית התפשטות גרורות רחוקות. שיטה זו גם יש את הפוטנציאל להיות משולב בסופו של דבר עם שיטות הדמיה אחרות בסביבה vivo.

Protocol

1. שורות תאים, בנייה וייצור וקטור lentiviral

1. ראש האדם תאים סרטניים בצוואר קווי (OSC19 או UMSCC1) היו בתרבית התקשורת מלאה המורכבת DMEM (חתול Cellgro # 50-003-PB) בתוספת 10% עוברי שור בסרום FBS (חתול Hyclone # SH30070.03), פניצילין 1% / סטרפטומיצין (חתול Cellgro # 30-002-CI), ו -1% שאינם חיוניים חומצות אמינו (חתול Cellgro # 25-025-CI).
2. כדי להעביר את רצף LifeAct-mCherry קידוד לתוך וקטור pLL7.0 lentiviral, האתר Sbf1 הכרה mCherry ההורה cDNA שונתה על ידי הצגת שלוש מוטציות שקט לתוך רצף הכרה באמצעות אתר מכוונת mutagenesis (חתול Stratagene # 200518-5). וכתוצאה מכך שונה LifeAct-mCherry רצף אז PCR מוגבר עם איגוף EcoR1/Sbf1 אתרים subcloned לתוך pLL7.0 ליצירת לבנות pLL7.0-LifeAct-mCherry.

2. pLL7.0-LifeAct-mCherry וירוס הפקה

1. ייצור ויראלי נערך על פי הביטוי lentiviral מערכות ידנית (גרסת מערכת Bioscience 2-051018).
2. התא אריזה קו 293T/17 תאים (חתול ATCC # CRL-11268) היה גדל מפגש 40% בתקשורת להשלים אותה משמש עבור קווי HNSCC.
3. תאים היו transfected עם pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2, ו-G pVSV וקטורים ביחס 03:02:01, בהתאמה באמצעות CalPhos (חתול Clontech # 631312).
4. לאחר 24 שעות, התקשורת הראשונית transfection הוחלף עם מדיה חדשה.
5. מדיה נאסף אז מתחדש כל 12 שעות למשך 72 שעות ו המאוחסן ב 4 ° C.

3. הפקה של ראש צוואר שורות תאים עם הביטוי LifeAct mCherry-Stable

1. התקשורת אסף היה סובב בסל"ד 2000 למשך 10 דקות 4 ° C.
2. אחת מ"ל של התקשורת הבהיר המכיל וירוס נוספה ישירות OSC19 או UMSCC1 התאים למשך 12 שעות. תאים שהיו שטופים אז, מ"ל נוסף אחד וירוס נוספה לתקופה נוספת 12 שעות ביממה.
3. תאים שטופלו מדיה המכילה puromycin 200mg/ml למשך שבועיים כדי לבחור מושבות עמידים.
4. שיבוטים לשרוד הוקרנו ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לביטוי LifeAct-mCherry. מושבות חיובית בודדת היו typsinized שימוש סטרילי דיסקים שיבוט 3mm (חתול פישר 0790710A #).
5. תאים חיובית נשמרו בתקשורת המכיל puromycin 200mg/ml עד קפוא בחזרה או המשמש להזרקת orthotopic.

4. Orthotopic xenograft גידול גיבוש

1. הנהלים כל חיה נערכו בהתאם לפרוטוקול (09-0821) אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה המערבית ועדת שימוש.
2. LifeAct-mCherry תאים סרטניים להביע היו trypsinized, centrifuged ו 2.5 x 10 ⁴ תאים היו resuspended ב 50 התקשורת להשלים μL.
3. תאים סרטניים הועמסו מזרק אחד מ"ל מצורף מחט מד 27 וחצי.
4. נקבה athymic Fox1 ^{נו / נו} עכברים 8 שבועות של גיל (הרלן מעבדות) היו מורדמים עם שילוב של 80mg/kg xylazine קטמין ו 10mg/kg. בעכברים מורדמים נשמרו בין 37-40 מעלות צלזיוס על כרית חימום.
5. בעזרת מלקחיים סטריליות, קצה הלשון היתה תפס בעדינות ומשך בקפידה מתוך חלל הפה.
6. הוזרקו תאים לאט לתוך צד אחד של הלשון כל כדי ליצור מסה בולבוסי במרכז הלשון, הימנעות העורקים לשוני.
7. עכברים הוזרקו yohimbine 2.1mg/kg וחזר כרית חימום שם היו במעקב במשך 2-3 שעות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה.
8. החיו פעם, עכברים הונחו לתוך כלובים סטרילי המכיל דיאטה בצק רך מהונדס (חתול Bioserve # S3472).
9. עכברים נשקלו כל 2-3 ימים פיקוח חזותי עבור הופעת הגידול.

5. הכנת לשונות עכבר והדמיה Ex-vivo

1. עכברים מחסה גידולים בנקודות זמן שונות (בדרך כלל 2-4 שבועות לאחר ההזרקה) היו מורדמים משאיפת פחמן דו חמצני.
2. לשונות חולצו, שטפה עם 1X PBS ומצורפת צד אחד של קלטת פרפין קונבנציונאלי רקמות הטבעה (חתול StatLab # H104,) באמצעות חוט תפירה monofilament מהחנות תחביב מקומי 8 גודל המחט.
3. לאחר לשונות היו משותקים, הרכבה את הקלטת כולה הונחה צלחת רקמות 30mm תרבות שקוע 1X PBS.
4. לשונות מעובד שימשו מיד מיקרוסקופיה שני הפוטונים עירור.

6. הדמיה של גידולים לשון עם מיקרוסקופיה שני הפוטונים

1. קלטות לשון היו שקועים בצלחת 60mm המכיל 1X PBS מאובטח בפומית אישית מעוצבת על זרוע שלוחה נשלף (לשכת מעבורת, Siskiyou מכשירים) ממוצבת תחת המטרה של מיקרוסקופ זקוף (מיקרוסקופ נייד (MOM); מכשירים סאטר).
2. טבילה במים 40X/0.8NA העדשה אובייקטיבית הונחה ישירות או דרך הקיבה גלויאו נגעים. לשונות היו הדמיה במיקרוסקופ על ידי שני פוטונים עם טי: ספיר לייזר (מירה, קוהרנטית) בעוצמה על 60 mW אורך הגל קלט של 755 ננומטר כדי לייעל את האות mCherry.
3. סידורי 1mm תמונות סריקת לייזר נאספו במעמקי מצטבר 1 מיקרומטר מעל לעומק הרקמה הכוללת בין 15 ל 100 מיקרומטר (תלוי בנפח הגידול). תמונות שנתפסו באמצעות ScanImage, תוכנית הקוד הפתוח מבוסס על פלטפורמת MATLAB אשר פותחה על ידי קארל סוובודה מעבדה (Janelia חוות, HHMI). ScanImage מייצר פלט שני ערוצים של דפוסי סריקה סריקה לשלוט X / Y galvanometric מראות לסרוק בו זמנית לוכדת הזנה מקסימלית ארבעה ערוצים בו זמנית האות מ צינורות מכפיל (PMTs) באמצעות רכישת לוח נתונים (PCI-6610S , National Instruments). האותות PMT הם מוגבר על ידי preamplifiers רעש נמוך הנוכחי (SR570, מערכת סטנפורד מחקר) לפני האכלה לתוך הלוח NI-DAQ עבור התצוגה על המסך. ScanImage אוספת Z-מחסנית תמונות על ידי שליטה על ציר Z-המטרה ואוסף זמן לשגות תמונות במצב בודד או מחזור. תמונות שנשמרו בקובץ TIFF יחיד עם עומק 16 ביט.

7. תמונה ניתוח באמצעות עמירה תוכנה

1. עמירה הדמיה עבור כימות גידול: בשנת תוכנה Aimra, לפתוח את קובץ TIFF המכיל את מערכת Z-ערימת תמונות.
2. סמנו את שם הקובץ, לבחור וליישם את הפונקציה Voltex כדי ליצור עיבוד תלת מימדי. תמונה גדולה הגידול הראשוני עם מספר קבוצות קטנות יותר פולשנית ניתק (IG) של התאים פלשו קולקטיבי ניכר בדרך כלל בתמונה שניתנו (ראה איור 6 א).
3. כדי לבחור את מסת הגידול הראשוני, בחר "נתוני פתיחה", ואז "תיוג", ואז "שדה לייבל".
4. Thresholding העיקרי גידולים לבחור את כל Z-מחסנית תמונות לגלול את התמונות במישור-z כדי להבטיח את הכללתו של מסת הגידול הראשוני רק בתוך בשלושה ממדים. זה בדרך כלל את התמונה בגודל הגדול ביותר בתחום, ולעתים קרובות מופיע מפולח כמו הדמיה חוצה דרך מישור-z.
5. השתמש בפונקציה שרביט קסמים / סף לתקן הקרינה רקע ולחסל אותו מהתמונה מבלי לזנוח כל אות הגידול. סמן את "קובץ בתוך" תווית ולחץ על כפתור ⊕. בחר את "כל Slices" תיבת הסימון. זה מייצר גבול צבעוני סביב אזור הגידול thresholded הראשוני תוספת Z-מחסנית כל.
6. כדי לבחור IGS, בחר את הפונקציה "חדש". בחר IG אחת להבטיח שזה לא קשור הגידול הראשוני ידי גלילה דרך מישור-z.
7. בחר "כל Slices" ולחץ על לחצן ⊕. שנה את שם הקובץ (לשעבר: IG 1)
8. חזור על הליך thresholding ב 7.4 ו ב 7.5 צעד המדגיש את IG נקבע. בחר צבע מתאר שונה מאשר צבע המשמש כדי לציין את מסת הגידול הראשוני.
9. חזור על הצורך של כל IG נוספים ברחבי התמונה, סריקה באמצעות מטוס-z כדי להבטיח את כל IGS מסומנים. שימוש בצבעים שונים עבור כל זיהו IG מסייע בזיהוי עתידי על התמונה.
10. לאחר הגידול הראשוני וכל IGS נבחרים, בחר "פילוח" מתוך התפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר "סטטיסטיקה חומר". זה מספק את מדידת נפח, כמו גם את X, Y ו X הליבה הגידול קואורדינטות עבור הגידול הראשוני על מנת לחשב מרחקים של IGS מנקודת הגידול המרכזי.
11. עם כרכים המחושב, לקבוע את המרחק של כל IG מן הליבה המרכזית של הגידול הראשוני. בחר "פילוח", ואז "סטטיסטיקה חומר". צעד זה מחשב את כל המדידות לתוך פיקסלים. המרת פיקסלים מיקרומטר המבוססת על כיול של המטרה מיקרוסקופ וכל מגביר נוספים הגדלה (כלומר: פונקציות זום). עבור המיקרוסקופ והגדרות המשמשים בניסויים אלו, המטרה 40X שימש עם זום אין, מתן כיול של 1 פיקסל = 0.298 מיקרומטר. ייבוא ​​נתונים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel, אשר נותן פרמטרים הגידול הראשוני בשלושה ממדים (X1, Y1, Z1) ועבור כל IG (לשעבר: X2, Y2, Z2 של IG הראשון).
12. המרחק פלשו ב מיקרון עבור כל IG ממרכז הגידול הראשוני מחושבת באמצעות הנוסחה √ ((X2-X1) ² + (Y2-Y1) ² + (Z2-Z1) ^2).
13. המדד פולשני הגידול (T _אני) מחושבת באמצעות הנוסחה T _אני = N _T x V _T x ד _T, כאשר N _ט = המספר הכולל של IGS בתמונה, V _ט = נפח הכולל של כל IGS, _D-T = המרחק הכולל של כל הקבוצות נסעו פולשנית ממרכז הגידול הראשוני.

8. שלושה renderings ממדי עם תוכנה ש"ח, אלמנטים ניקון

1. שלושה renderings ממדי עם פירוט טופוגרפי יותר יכול להיווצר באמצעות ייבוא ​​המקורי של 16 סיביות קבצים מונוכרום TIFF של התמונה הגידול כולו לתוך התוכנה ניקון ש"ח-Elementsהחבילה (ניקון, מלוויל, ניו יורק). בחר "קובץ", ואז "ND", ואז "צור קובץ ND מתוך רצף קובץ". בחר את מחסנית סדרה Z-TIFF התמונה לציין את גודל הצעד המתאים.
2. כייל את המסמך ND במישור xy. ציין את גודל פיקסל אחד באמצעות כיול ידני.
3. בחר את "הצג את Volume". השתמש "מטה" הפונקציה כדי לחשב פרוסות נוספים במישור-z עבור באיכות גבוהה יותר. ב "הגדרות 3D מפיק", השתמש "מתקדם מפיק" עם איכות של "פרטים גבוהה במיוחד" ו "ברזולוציה מלאה". בחר "מיזוג אלפא" להדגיש את משטחי הגידול.
4. מטב את התמונה תלת ממדי עבור המצגת. קרב על הגידול הקשורים IGS ואת היבול לפי הצורך. סובב את התמונה המטוסים xyz ולהתאים את LUTs.
5. צלמו את התמונה עבור מצגת. בחר "ערוך, צור תצוגה Snapshot (8 bit RGB)". שם לשמור את הקובץ בהתאם.

9. נציג תוצאות

באיור 1. סכמטית בסך הממחישות שלבים עיקריים בייצור לשון orthotopic הגידול בתחום ההדמיה באתרו פוטון השניים.

איור 2. הזרקה של LifeAct-mCherry להביע OSC19 תאים לשפת העכבר.

איור 3 resected גידול המכילים לשון העכבר מוכן הדמיה two פוטון.

איור 4. אוריינטציה הלשון הגידול המכיל בעמדה על מיקרוסקופיה שני פוטון מוכן הדמיה.

איור 5. במסך נציג ירו מתוך ScanImage הוכחת רכישה הנתונים הגולמיים של התמונה שני הפוטונים הראשונית.

איור 6. ניתוח תמונה וכימות של הפלישה הגידול הגידול OSC19 orthotopic. נציג צילום מסך תמונות של עיבוד Voltex עמירה (א) ו יחיד thresholded Z-סעיף (ב) עם הגידול הראשוני העיקרי המפורטים בקבוצה, סגול פולשני 1 (IG-1) המתוארים כחול, IG-2 המתוארים אדום IG -3 המתוארים ירוק כדוגמה הליך הזיהוי. ראשי חץ לציין IGS ב (א) ו - (ב). מגרשים ג לעומת נפח פלש מרחק שמונה IGS בודדים המשמשים לחישוב המדד הפלישה הגידול (TI).

איור 7. תמונות הנציג של גידולים סרטניים פלשו קבוצות מתוך פרוטוקול זה לעומת תמונות מתוך גישה IHC קונבנציונאלי. סעיף א פרפין הלשון עכבר כל מחסה גידול UMSCC1 orthotopic. מכתים immunohistochemical נערך באמצעות נהלים קונבנציונלי עם נוגדן ראשוני נגד HNSCC ספציפיים סמן תא emmprin (Zymed; חתול # 34-5600) בשעה דילול 1:1000 ו דמיינו באמצעות DAB OmniMap נגד Rb ערכת זיהוי (Ventana חתול # 760 -149) ואחריו מכתים hematoxylin ברזל. תמונות המקיף את שטח הלשון סה"כ נאספו בנפרד בהגדלה 4X על מיקרוסקופ ZX70 Provis אולימפוס עם מצלמת CCD MicroFire אופטרוניקה ושיחזר באמצעות הדמיה StereoINvestigator החבילה (MBF Bioscience). הגידול מתבטא על קצה הלשון. האזור המורחב המראה הקדמית פולשני הפרט קבוצות תאים סרטניים (ראשי חץ) מוצג (B). טיוח C. ש"ח-Nikon אלמנטים של גידול OSC19 נציג. פרט מתאר משופרת להדמיה ברורה של IGS (ראשי חץ) ניכרת. בארים כל התמונות = 100 מיקרומטר.

Discussion

מודלים העכבר orthotopic הוכיחו שימושי לחקר היבטים רבים של סרטן הראש והצוואר ^1,2. יש לנו שילוב מערכת orthotopic מבוססת היטב של הסקוטי ³ עם הדמיה מיקרוסקופית שני הפוטונים של תאים mCherry שכותרתו כמערכת ללמוד את האירועים הראשונים של הראש והצוואר הפלישה גידול התא. בהליך זה, יש לציין כי תאים יכול לדלוף מאתר ההזרקה הגידול, בעיקר בעכברים שישה שבועות או פחות בשל גודל הלשון מספקת. אנו משתמשים עכברים מבוגרים, כדי למנוע בעיה זו. גודל הלשון גדול עם עכברים מבוגרים גם מסייע למניעת קרע של עורק לשונית דימום יתר מן הלשון. לקחת הגידול הוא משפר באופן דרמטי כאשר הלשון מתנפחת באתר ההזרקה הראשוני. שוככת זה נפיחות בתוך 1-2 שעות כמו הנוזל המוזרק נספג. הגידול מופיע מאליו 1-2 שבועות זריקה הודעה עם מספר הנייד הצביע על מוזרק כמו בליטה לבנה קטנה על פני הלשון. כמו כן, אנו מציינים כי על המטרה 40X שימוש במחקרים שלנו שהוצגו כאן, אנחנו לא יכולים להבדיל תאים סרטניים בודדים אך מזדהים IGS כאשכולות תא פולשנית כי לשחזר את מצב טיפוסי של הפלישה HNSCC.

עד כה במודל זה נעשה שימוש נרחב לבדיקת התפקיד של מולקולות ספציפיות, כמו גם מספר תרופות אנטי הגידול על הצמיחה Scot פלישה, עם יעילות נמדדת גרורות הצומת לימפה בצוואר הרחם לנטר באמצעות IHC או bioluminescent שיטות ^4-7. גידולים שנוצרו לידי ביטוי במערכת זו קרוב לפני השטח לשון (איור 7), המאפשר את היישום של מיקרוסקופיה שני הפוטונים גידולים התמונה כולה באתרו כמו רב הסלולר אשכולות פולשנית. ההליך יכול גם להיות מנוצל כדי להמחיש הפלישה הגידול עם רזולוציה הסלולר. מיקרוסקופיה דו פוטון נוצל בעבר ללמוד טיפולים ניסיוניים עבור סרטן הראש והצוואר ב ^8,9 ו orthotopic xenograft ^8,10 מודלים. עם זאת, ישנם שני הבדלים משמעותיים בין דוחות אלה פרוטוקול שלנו. ראשית, מחקרים אלה להשתמש בתוויות תאיים למקד / לזהות תאים סרטניים הראש והצוואר, אולי רק כדי להגביל את גילוי תאים סרטניים עם גישה נאותה במחזור הדם. הפלישה השנייה של תאים סרטניים קרוב ל האתר העיקרי משחזר סביר פעילות גרורתי מוקדם לא הוערך כפרמטר ניסיונית. פרוטוקול שלנו מספק את היכולת לכמת באופן ישיר הפלישה תאים סרטניים בכל נקודה במהלך התקדמות הגידול בלשונות העכבר. בעוד השיטה המתוארת כאן מתאר את ההליך באמצעות לשונות גזור, אנחנו נמצאים כרגע בתהליך של הסתגלות בשיטה זו כדי הפלישה הגידול התמונה עכברים חיים לשימוש בשילוב עם פליטת אור בו זמנית לפקח על הפלישה מוקדם, מעורבות קשרי לימפה מקומיות ו גרורות רחוקות אותו בעל חיים. שינויים בפרוטוקול עבור in vivo הדמיה דורשים עיצוב הבמה המתאימה מיצוב ושמירה על עכברים במהלך הדמיה, כמו גם מערכת מעשית שצריך להשקות את חלל הפה של בעכברים מורדמים במהלך ההליך הדמיה. אופטימיזציה פעם, עיבודים אלה יספקו את היכולת ללמוד את התפקיד של הפרו פולשנית מולקולות פוטנציאליות נגד פולשני לבדיקת תרכובות על הפלישה המקומית ומעורבות גרורות מרוחקות יותר אצל בעלי חיים על פני תקופות זמן ממושך.