Utveckling av celltyp specifika anti-HIV gp120 aptamers för siRNA leverans
Summary
Flera 2'-Fluoro RNA aptamers mot HIV-1Ba-L gp120 med nanomole affinitet är isolerade från en RNA-bibliotek genom att<em> In vitro</em> SELEX förfarande. En ny dubbel hämmande funktion anti-gp120 aptamer-siRNA hjärnspöke skapas och visar stort löfte för systemisk anti-HIV behandling.
Abstract
Den globala epidemin av infektion av hiv har skapat ett akut behov av nya klasser av antiretrovirala medel. Den potenta förmåga små störande (SI) RNA för att hämma uttrycket av kompletterande RNA-transkript utnyttjas som en ny klass av läkemedel för olika sjukdomar inklusive hiv. Många tidigare rapporter har visat att nya RNAi-baserade anti-HIV/AIDS terapeutiska strategier har stora löfte, men det är ett betydande hinder för en framgångsrik terapeutisk tillämpning och kliniska översättning av siRNA effektiv leverans. Särskilt med tanke på säkerheten och effekten av RNAi-baserade läkemedel, är det mycket önskvärt att utveckla en målinriktad intracellulära tillvägagångssätt siRNA leverans till specifika cellpopulationer eller vävnader. HIV-1 gp120 protein, ett glykoprotein kuvert på ytan av HIV-1 spelar en viktig roll för viralt inträde i CD4-celler. Samspelet mellan gp120 och CD4 som utlöser HIV-1 in och initierar cellfusion har validerats som ett kliniskt relevanta anti-virala strategi för läkemedelsutveckling.
Häri diskuterar vi först urval och identifiering av 2'-F modifierad HIV-gp120 RNA aptamers. Med hjälp av en konventionell nitrocellulosa filter SELEX metoden har flera nya aptamers med nanomolära affinitet isolerad från en 50 slumpmässigt nt RNA bibliotek. För att framgångsrikt få bundna arter med högre affinitet, är valet stringens kontrolleras noggrant genom att justera villkoren. Den valda aptamers kan specifikt binda och snabbt internaliseras i celler som uttrycker HIV-1 kuvert protein. Dessutom kan aptamers ensam neutralisera HIV-1-smitta. Baserat på den bästa aptamer A-1, skapar vi också en ny dubbel hämmande funktion anti-gp120 aptamer-siRNA chimär där både aptamer och de delar siRNA har potent anti-hiv-aktiviteter. Vidare använder vi den gp120 aptamer-siRNA chimärer för cell-typ specifik leverans av siRNA in HIV-1-infekterade celler. Denna dubbla funktion chimär visar stor potential för att kombinera olika nukleinsyra terapeutiska medel (aptamer och siRNA) i dämpning HIV-1 infektion, vilket gör aptamer-siRNA chimärer attraktiva terapialternativ kandidater för patienter som inte högaktiv antiretroviral terapi (HAART).
Protocol
Discussion
Aptamers är in vitro utvecklats nukleinsyror att anta specifika och stabila tredimensionella former, vilket ger mycket specifika, snäva bindning till riktade molekyler 8. Den låga nanomolära affinitet och utsökta specificitet aptamers till sina mål att göra dem mångsidiga verktyg för diagnostik, in vivo imaging och terapier 9. Med tillkomsten av aptamer teknik för riktade siRNA leverans är det nu möjligt att använda aptamer bindande funktion för receptor medierad end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer och Lisa Scherer för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health AI29329 och HL07470 tilldelas JJR Följande reagenser framställs genom NIH Aids-forskning och Reference Reagent Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH: Den CHO-EE och Cho-gp160 celler linje, den pNL4-3 luc vektor, HIV-1 BaL gp120 från DAIDS, NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
