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Immunology and Infection

のDNAフィンガープリント結核菌株 - 断片長解析(FLA)

Published: July 15, 2011 doi: 10.3791/3104

Summary

によって引き起こされるハンセン病、

Abstract

ハンセン病の伝送の研究は、病原以来、 結核菌はらい 、実験室で培養することができない特に困難です。細菌の唯一の源は、ハンセン病の患者、および実験的に感染アルマジロやヌードマウスです。従って、現代の疫学で使用されているメソッドの多くは、ハンセン病の研究のため使用できません。 WHO 1で実装されたハンセン病のための広範なグローバルな薬物治療プログラムにもかかわらず、ハンセン病は約25万の新たな症例は毎年多くの国では風土病のまま2全体M.らい菌ゲノムは、3,4をマッピングされており、多くの遺伝子座は、(マイクロおよびminisatellitesと呼ばれる)2つ以上の塩基対のセグメントを繰り返していることが確認されている。M. 5臨床菌株は、 らいこれらの遺伝子座の多くでタンデム繰り返しセグメント(ショートタンデムリピート、STR)の数が異なる場合があります。5,6,7可変数のタンデムリピート(VNTR)5分析は、ハンセン病菌の異なる菌株を区別するために使用されています。遺伝子座のいくつかは他の人が同じ患者でもある、より急速に変化するように見える一方、繰り返し数であまり変化を示す、他のものより安定しているようです。特定のVNTRsの変動は歪タイピング7,8,9のための適性に関する質問を育てているが、新興のデータは、その安定性で多様化している複数の遺伝子座を、分析し、貴重な疫学的ツールとして使用できることを示唆している。複数の遺伝子座VNTR分析(MLVA)10が中国11,12、マラウイ8、フィリピン10,13、およびブラジル14を含むいくつかの国でハンセン病の進化と伝達を研究するために使用されています。 MLVAは、複数の手順が含まれます。最初に、細菌のDNAは、臨床生検またはスリットの皮膚スメア(SSS)から宿主組織のDNAと一緒に抽出されます。10は 、目的の遺伝子座は、その後、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を経由して抽出したDNAから増幅されています。 4月5日別の遺伝子座のための蛍光標識プライマーを10 PCR産物が所望のDNAセグメントの存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動に供されることがあります。18遺伝子座は4つの反応の合計で増幅されていると、反応ごとに使用、とされていますキャピラリー電気泳動を用いた蛍光断片長解析(FLA)のために提出。各遺伝子座の繰り返しコピーの数がわかっているアルマジロ継代細菌からのDNAをポジティブコントロールとして使用されます。 FLAのクロマトグラムは、 ピークスキャナのソフトウェアと断片の長さを用いて検討しているVNTRのコピー数(対立遺伝子)に変換されます。最後に、VNTRのハプロタイプは、パターンが分析され、そして患者の臨床データと組み合わせることで、歪みの種類の分布を追跡するために使用することができます。

Protocol

このビデオの記事の目的は、ちょうどこのタイプの作品の( 図1)を起動することができる研究者のためのデータ形式と解釈とともに、作業の流れの概要を提供することです。それは以前に出版された作品で説明されている手法、簡略化されたプロトコルと実用的なヒントのデモが含まれています。5,10

一般的な作業の流れと研究室の設備:

この種の研究のための少なくとも3つの独立したワークエリアがあるはずです。研究室では、PCRプライマーの調製のためのフード(クリーンエアボックスまたは分離された作業領域)(希釈、分注しの準備と混合)、2)の処理を別のバイオセーフキャビネットとDNAの添加で)プレPCR領域を1が必要ですPCR混合物に、および3)PCR後の作業領域ゲルを調製し、ロードするためとFLAのためのサンプルを準備する。プライマーとDNAサンプルは、別の冷凍庫や冷蔵庫に保管する必要があります。プライマーのコンタミネーションは、このタイプの実験室での作業の責任者と最も永続的な問題の一つです。プライマーとPCRミックスに使用されるピペットは、DNAに利用してはいけません。あらかじめPCR、PCRおよびPCR後の作業領域用ピペットの別個のセットがあるはずです。一般に、ある研究者は、標準的な実験装置を使用して、12〜24時間の期間に12から18サンプルを処理することができます。

作業の各フェーズを開始する前に:

  • 白衣と手袋を着用してください。手袋は、いつでも生物学的サンプル、プライマー、DNA及び臭化エチ​​ジウムが処理されて着用してください。頻繁に手袋を変更します。
  • PCRキャビネットフード、生物学的安全キャビネットまたはクリーンな作業領域で動作する。
  • 新鮮なベンチの紙やパッドを使用してください。
  • 液体やピペットチップに適した廃棄物のレセプタクルを設定します。
  • PCRのフードと70%エタノールでピペットの内部を拭いてください。
  • PCRをセットアップする前に15分間UV光を受けるピペットと作業領域。 (紫外光架橋表面DNAの汚染物質。)
  • 常にDNA、プライマーおよびPCR用試薬を含む材料のエアロゾル防止のピペットチップを使用してください。
  • 処理によってエアロゾルのエスケープとクロスコンタミネーションを防ぐために、開く前に、液体を含むチューブ/ストリップ/プレートを遠心する。

(1)M.らい DNA調製

M.を含む臨床サンプルらい皮膚クリニックを訪れ、ハンセン病患者から取得されます。通常の診断のサンプルは、皮膚のパンチ生検、スリットの皮膚塗抹標本または鼻腔スワブ可能性があります。彼らは汚れていないとM.の十分な量が含まれているため、一般的に、パンチ生検またはスリットの皮膚の汚れが分子疫学に最適ですらい 。研究のためのこれらの材料の使用は、制度的なガイドラインに従って承認されなければなりません。

  1. 70%エタノール1 mlのあるスクリューキャップバイアルに皮膚スメアサンプルを生検またはスリットを維持する。
  2. 15分間12,000 xgで可変速度ベンチトップ遠心機で各サンプルを遠心分離します。
  3. 上清を除去し、マイクロ遠心チューブに入れてください。必要であれば、それは再度遠心これらの試料の場合に便利ですし、後で追加の組織やDNAを回復することができます。
  4. 組織サンプルに(PBS)リン酸緩衝生理食塩水500μlを加え、残留エタノールの防腐剤を交換し、サンプルを再水和するために1時間浸す。
  5. 20分間12,000 xgでベンチトップ遠心機でサンプルを遠心分離します。部分的に消毒液で満たされた廃棄物のコンテナ内のPBS溶液を捨てる。
  6. 処方のガイドラインに従って、キアゲンDNEasy血液と組織のキットを使用して細菌のDNAを抽出します。
  7. 抽出されたDNAは、4バイアルに等分されるべきである。 -80℃ストア2分注し° C今後の使用のための新技術が利用できるようになるときに試験結果の再現性が要求されている場合、または/時。格納する1つ-20℃で分注し、4一℃、より即時の使用のためのC。
  8. それは、組織サンプルと一緒に"抽出の空白を"準備するのが賢明です。ブランクは、上に概説が組織することなく実行されるすべて同じ治療に供される。 PCRは、患者検体と一緒に抽出空白は演算の抽出手法が正しいことを保証し、その試薬は、DNAのコンタミネーションの自由です。

2。プライマーの準備

  1. 最も広範な歪みタイプのデータが存在するために遺伝子座に対するプライマーを表1に記載されています。四または5のプライマーをマルチプレックスPCRのために結合されます。各遺伝子座についての一方のプライマーは、キャピラリー電気泳動断片長解析(FLA)中に検出される5'蛍光化学タグを運びます。
  2. 1チューブでフォワードプライマー、別の逆:各マルチプレックスPCRの組み合わせに対して、タグ付けされたプライマーおよび各遺伝子座に対応するリバースプライマーは、別のエッペンドルフチュー​​ブに結合されています。株式のプライマーは100μMのソリューション( 図2a)、の一部として用意されていますTE(1Xトリス- EDTA、pH 8.0)を用いて10μMの濃度に10倍希釈する。 100μMのプライマー溶液の残りのアリコートを、後で使用するために-20℃で保存されています。
  3. 各10μMのプライマーの等量は、各プライマーの2μmの最終濃度になる混合される。プライマーの組み合わせはPCR混合物( 表3)に追加されると、各プライマーの最終濃度は0.2μMに低下します。

組み合わせのプライマーをPCR混合物(表3)に追加されると、最終濃度は、0.2μmの各々にドロップします。

3。マルチプレックスPCRを用いた増幅細菌DNA

  1. PCRセットアップ
    • 使用されるサンプル数を記録し、必要なプラスチックと他の材料を収集する前に、必要な試薬とそのボリュームでワークシートを準備。
    • サンプル番号を持つPCRに使用される滅菌チューブ/ストリップ/プレートにラベルを付けます。ポジティブとネガティブコントロールを含めることを忘れないでください。
  2. それは表2にしたがって洗浄液(例えばDecon ELIMINaseなど)を持つサーマルサイクラーやプログラムを拭う清掃後、プライマーおよび他の試薬 ​​を取り扱う前に手袋を変更します。
  3. 使用するプライマーの組み合わせとサンプル番号を持つPCRチューブ/ストリップ/プレート表3とラベルに応じてPCRマスターミックスを準備します。
  4. 各標識PCRサンプルチューブまたはウェルにマスターミックスのアリコート18μl。手袋を変更します。
  5. 任意のDNA汚染物質を架橋するために15分間UV光への作業領域およびピペット主題その後、作業領域やツールをきれいにし、消毒するための70%エタノールで別々のバイオセーフティキャビネット及びピペットを拭う。手袋を変更します。
  6. クリーンバイオセーフキャビネットでは、20μlの(図2b)の合計量を取得するだけでなく、各PCRチューブ/プレートにマスターミックスするDNAテンプレートの2μlのを追加します。 すべての液体材料のエアロゾル防止のピペットチップを使用してください
  7. 内容物を混合するために簡単にPCRチューブ/ストリップ/プレートを遠心する。
  8. クラーにサンプルチューブ/ストリップ/プレートを置き、PCRプログラムを起動します。
  9. プログラムが完了すると、4でサーモとストアから製品を削除° Cを電気泳動するまで。

4。 PCR産物のゲル電気泳動

*このプロトコルは、長年にわたって標準でしたし、PCR産物の確認はFLAのためにそれらを送信する前に希望する場合は採用することができるオプションの手順ですしています。

  1. 別々のPCR後の作業領域では、2%アガロースゲルを準備する。 1X TBEの2.0グラムアガロースpowder/100ml(トリス/ホウ酸/ EDTA)フラスコ内の緩衝液を使用してください。電子レンジで約1.5〜2分間混合物を加熱する。渦巻内容、アガロースを溶解するために必要に応じて再び加熱する。わずかに冷却し、試料のための十分な井戸で櫛を使用してフォームでゲルを注ぐ。
  2. 4からのPCR産物を除去℃、約30秒間遠心する。
  3. 5倍または6倍ゲルローディングバッファー(ローディングバッファーは、様々な会社から利用できる、または研究室にまで混合してもよい。レシピをオンラインで利用できる。)0.5 -1μlのあるミックスPCR産物の2 ​​-5μlの
  4. 6μlサンプル/ローディングバッファーを混合してゲルのウェルをロードする。 1つのよく(好ましくは20 bpのラダー)に分子のはしごを追加。
  5. 約90分間、100Vでゲルを実行します。
  6. 時間の同量のために超純蒸留水にし、15〜30分間臭化エチジウム溶液にゲルを浸し。
  7. 画像ジェルをUVライトが適用されている間。組み合わせ4〜5のDNAセグメントのそれぞれ( 図3)のためのバンドがあるはずです。
  8. 機関の有害物質の方針に沿ってゲルを廃棄してください。エチジウムブロマイド溶液は、適切な廃棄の前に複数回使用することができます。

5。断片長解析のための準備サンプル(FLA)

  1. 清潔なエッペンドルフチュー​​ブに、テストする各サンプルのためなGeneScan -500 LIZサイジング標準(アプライドバイオシステムズからの両方)の新鮮なアリコートおよび0.3μlからHi -ジホルムアミド溶液の12μlを含むマスター混合物を準備する。 (ハイジホルムアミドは化学的に加熱の必要性を排除する、電気泳動をキャピラリーに先立ってDNA鎖を変性。)各ウェルのサンプルとセットに使用されているため、96ウェルの光質反応プレート、ホルムアミド、リズミックスのアリコート12.3μlを使用して脇板。
  2. DNAサンプルを各ウェルになっているかを示す自分の記録( 図4a)のためのプレートのマップを作成します。
  3. チューブ/ストリップまたは96ウェルプレートを用いて、PCR産物の1:60希釈を作成しPCRの品質の水の59μlにPCR産物の1μlを( パート3から)を追加。希釈液は、ゲルのバンドのFLAデータや明るさから信号強度に基づいて調整されることがあります。 DNAのさらに低い濃度の場合があります(1:120または1:180)で十分です。
  4. ホルムアミド-リズ混合物を含むプレートに正しいウェルに希釈したPCR産物の1μlを追加します。
  5. PCRはまた、96ウェルプレートで行われていた場合、通信速度と効率が大幅に向上させることができる。一つは、単に順番に3などのプレートを並べることができます。PCR産物は、PCR産物の希釈用の滅菌水でプレート2、およびホルムアミドおよび断片長解析のためのサイジングはしご付プレート3プレート1。マルチチャンネルピペットは、FLAの準備の迅速なプロセスが可能になります。

遺伝アナライザを経由してサンプルの分析

  1. メーカーの指示ごとに適用さflurophoresを検出するために遺伝アナライザを校正します。リズを含む色素セットを使用してください。
  2. 水は容器をリンスし、チャンバをバッファリングするEDTA(1X)(Applied Biosystems社)で新しいランニングバッファーを追加補充する。
  3. 板にスリット入りのシリコンのセプタムを追加し、設計された保持トレイにプレートを置く。オートサンプラ前進をもたらす遺伝アナライザ上で"トレイ"ボタンを押してください。オートサンプラの上にトレイを置き、遺伝分析への扉を閉じます。
  4. 分析のためのスプレッドシートを作成またはインポートします。インポート可能なファイルは。PLTの拡張子を持っているし、タブ区切りの形式です。ファイルは、Excel(マイクロソフト)または同様のプログラムで変更することができます。
  5. サンプルは15秒間に1.6 kVの注入電圧を印加することによりキャピラリー(50 cmの長さ、POP - 7ポリマー)に注入されていますキャピラリー電気泳動法は、1800秒間60℃で15 kVの電圧で動作します。プロセス全体は、約45分かかります。
  6. 実行が完了したら、分析した各サンプルのデータは。FSAの拡張子を持つファイルに変換し、プレートのファイルのフォルダ( 図4b)に配置されます。各データファイルのサイズは約100 KBで、フラッシュドライブに保存したり、圧縮しメールで送信することができます。データファイルは、このようなABIのGeneMapperまたはピークスキャナとして、適切なソフトウェアを使用して表示することができます。

6。フラグメントの長さの結果の分析

  1. 蛍光キャピラリー電気泳動からデータの解析には、特別なソフトウェアが必要です。そのようなソフトウェアが利用できない場合は、 アプライドバイオシステムズ社のウェブサイトに移動し、 ピークのスキャナをダウンロードしてください 。ソフトウェアは無料で、非常にうまく動作します。 https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. オープンピークスキャナと"ファイルの追加"に続いて"新規プロジェクトを開始します"。ポジティブおよびネガティブコントロールを含む、選択された。FSAのデータファイルをプログラムに、ロードする。
  3. を選択します(ハイライト)とすべてのロードされたファイルを"分析"。 GS500(-250)と分析方法:各サンプルは、"サイズ標準に設定されていることを確認してください。サイジングデフォルト- PPを押して"分析"。
  4. サンプル中のDNA断片が生成される各色のピークの塩基対の大きさを調べます。
  5. 塩基対の各ピークサイズの値を記録し、陽性対照のピークと比較してください。
  6. 陽性対照試料のピークは、塩基対と4-7表に記載されているタンデムリピートの対応する番号の数字に匹敵してください。
  7. 陽性対照との比較により、各サンプルの対立遺伝子に存在するどのように多くの短いタンデムリピートセグメントを決定します。我々は、検証される各遺伝子座でのVNTRのコピーの数のために配列決定されたNHDP63を使用してください。4
  8. 比較および/または数学的解析のためのスプレッドシートに記録されたデータを入力してください。 VNTRの指紋"またはハプロタイプ、M.の特徴的な定義の遺伝子座で対立遺伝子の文字列ですらい負担。

7。代表的な結果

PCR産物のゲル電気泳動では、うまくいけばプライマーの組み合わせで各遺伝子座( 図3)のためのバンドが生成されます。 図3では、ゲルに2つのセクションがあります:上部のセクションでは、1 PCRサンプルと下部の組み合わせ2のサンプルを組み合わせています。各セクションは、8患者のサンプルから得られたPCR産物に続いて20塩基対の分子はしごを、含まれています。組み合わせ1はまた、最終的に、ネガティブコントロールとポジティブコントロール(NHDP63株を)持っています。 (組み合わせ2のコントロールが別のゲルにあった。)ほとんどの試料が明確組み合わせで各遺伝子座のための5バンド、1を表示することに注意してください。いくつかのケースでは、バンドも唯一の4つのバンドの出現で、その結果、別の遺伝子座として表示するために一緒に閉じる可能性があります。

予想されるアンプリコンのサイズは表1に記載されています当研究室では、M.のNHDP63菌株を使用するらい菌陽性対照として。繰り返しセグメントの2つのタイプが検討されている:マイクロサテライト遺伝子座(1-5ベースと共にリピート)とミニサテライト遺伝子座を(5塩基対が複数回繰り返されるよりもセグメントがある)。

キャピラリー電気泳動からデータファイルの解釈は、2つの規格に依存しています:内部DNA断片のサイズ規格はなGeneScan - 500LIZ(ABI)と増幅細菌DNAの外部陽性対照サンプルと呼ばれる。

FLAクロマトグラムは、 ピークスキャナのソフトウェアを使用して表示する、 図5a、5bおよび6で見ることができます。

ピークスキャナは、アンプリコンのサイズ(塩基対のx軸)と信号強度(y軸)上のデータを提供します。サイズとピークの高さの値が最も重要であるが( 図5b)、ピーク面積、等の追加データには、もご利用いただけます。高さが100台​​未満のピークは通常、信頼できるものをあまりにも弱い信号とみなされます。

図6は、遺伝子座(GTA)9時タンデムリピート数の変化を示し、陽性コントロール(NHDP63)と2つの患者のサンプルを比較します。ポジティブコントロールでは、シーケンス(GTA)は10回繰り返されます。 NHDP63 VNTRとアンプリコンのサイズは、遺伝子の配列決定によって確認した。患者4のPCRアンプリコンは、患者6は11繰り返し(GTA)を明らかにNHDP63より3塩基大きいアンプリコンを有しながら、わずか9の繰り返し単位が、あることを示す陽性対照より3塩基小さいです。患者は2したがって、ほとんど、あるいはまったくDNAのPCR複製、​​低細菌のインデックス(BI)、無FLAの信号を持っていた。

FLAデータの解釈の難しさは、時々"吃音"の結果として発生します。 PCR反応中に、DNAポリメラーゼは、ソースの対立遺伝子よりも長いまたは短い1回以上の繰り返しなの断片を生成することがあります。これらは通常、メインピークを周囲より低い高さのピークとして認識されます。彼らは、主ピークよりも大きかったり小さかったりの繰り返しセグメントの塩基対の正しい数であることを"はしご上'になります。結果は同じ色のピークのファミリーです。 図7は、遺伝子座(TA)10でこれを示しています。

時々FLAで遭遇別の難しさは、DNAポリメラーゼは、[()通常アデニン]シングルベースを追加したコピーのDNAセグメントの3'末端に、'+'または'-テーリング'を含む。これは、 図8に示すように、隣接するピークが1塩基対の大きいメインまたはスタッターピークの右側にあるピークとしてFLAに表示されます。それは、メインまたはスタッターピークと混同しないようにしてください。主なピークとそのA -テールは、単一の種と見なされます。 A -テールは、VNTRのリピート数を変更しません。 (一部のDNAポリメラーゼのキットは、特にこの交絡影響を軽減するためにテーリングを促進するために設計されています。推進テーリングを完全に単一のピークよりもピークのペアを生成する傾向があります。)

DNA抽出とPCR産物は、M.の両方が含まれているらい菌と人間のDNA、しかし18(TA)を除いて、プライマーは、彼らが唯一の細菌DNAを増幅するのに十分な固有のものであり、そしてほとんど、またはまったく人間のDNAの増幅があります。 (TA)18は、しばしば人間のDNAからのものであり、アルマジロ継DNAサンプル( 図9)に見られるようにされていない242塩基対のピークを生成します。

プライマーの貯蔵寿命は、提供それらが-20℃、唯一の直接の使用のために削除さに保たれている一般的に良いですし、消費° Cまで4℃で保管。プライマーは4℃で1-2週間で安定している必要があります。 PCR用プライマーの組み合わせを作ることは多少時間がかかるにもかかわらず、それはすぐに使用するための唯一の十分なプライマーの組み合わせが用意されることをお勧めします。プライマーの組み合わせは、長期間保存した場合は多少低下するようです。

TEは、大規模な株式を分注しされるべきである、とアリコートはどちら冷凍または室温で保存することができます。 200 -400μlの大きいアリコートは、乾燥または濃縮プライマーの株式( 図2a)を希釈するのに適しています。 10〜50μlの小さいアリコートは、プライマーの組み合わせを3と4のボリュームを補うために便利です。 TEは安価であり、アリコートを使用後に廃棄されるべきである。

多重酵素のキットは非常に高価であり、使用時まで(-20℃)凍結保存してください。 PCRの調製後、使用されていない多重ソリューションは4℃にすぐに返されるべきである小さなキアゲンマルチプレックスPCRキットは、マルチプレックスミックスの3管、ソリューションの各含む0.85ミリリットル(850μl)が付属しています。十分な約65〜70 PCRのために。

一般的に、DNAサンプル、プライマーおよび多重キットのソリューションを含む、実験室の仕事のこのタイプで使用される材料を繰り返し、大きな温度変化を避けるのがベストです。すべての材料が必要になるまで-20℃で保存し、そして消費されるまで、その後4℃に保つ必要があります。 DNAの長期保存は-80になっているはず℃に

費やした組織、プライマーおよび/またはDNAを含むすべての材料はオートクレーブして廃棄する必要があるときに、利用されるのはもはや。処理されたすべてのサンプルエチジウムブロマイドまたはホルムアミドとの有害廃棄物として処理し、金融機関の有害物質のポリシーに従って廃棄してください。

表1
表1:ひずみNHDP63のアンプリコンのサイズ

表2
表2:VNTR PCRのためのサイクリングパラメータ

表3
表3:PCRの調製

表4
表4:組み合わせ1のアレルコール

表5
表5:コンビネーション2のアレルコール

表6
表6:コンビネーション3のアレルコール

表7
表7:コンビネーション4のアレルコール

図1
図1:VNTR - FLAのプロセスフロー図

図2
図2。組み合わせ1アッパープライマーの(a)の準備(のエッペンドルフチューブ画像礼儀www.clker.com )。 (B)PCRのセットアップ(8 PCRのための)(www.clker.comのエッペンドルフチュー​​ブの写真の礼儀)

図3
図3。組み合わせ1と2 VNTR PCR産物のDNAのアガロースゲル

図4a
図4b
図4。 (A)FLA板マップ(b)の FLAデータのファイル:*. FSA

図5a
図5b
図5。組み合わせ1 VNTRローカスのためのポジティブコントロールの(A)FLAのクロマトグラム(NHDP63)。(B)のアンプリコンの大きさと豊かさのピークスキャナデータ(GTA)9

図6
図6。遺伝子座のためのPCへのPCRサンプルの比較(NHDP63)(GTA)9

図7
図7。(TA)10の主とスタッターピーク

図8
図8:メインまたはスタッターピークに隣接+ A(A -尾部)のピーク。

図9
図9:(TA)18メインピーク、スタッターピークと人間のDNAのピーク

図10a
図10b
図10: らい VNTRのデータに基づいて、M.の(A)のひずみ分化M.(B)ひずみ分化。 らい MLVA DNAフィンガープリントに基づく

Discussion

ハンセン病の患者から皮膚サンプルの収集は、皮膚クリニックで働く熟練した臨床医や技術者が必要です。これらのサンプルを扱う研究室の労働者は、白衣、手袋、保護メガネを着用を着用し、人間やアルマジロ組織の感染サンプルを取り扱う際にはバイオセーフティキャビネット内で動作するように細心の注意を払う必要があります。面とツールの消毒も重要です。清潔、滅菌バイオセーフキャビネットでの作業は、DNAサンプルの汚染を回避するために重要です。

DNA抽出は、キアゲンのような企業から抽出キットの開発に比較的容易に感謝となっています。指示に注意深く従っている必要があります。使用しないときは全てのサンプルは低温に保たれるべきである。サンプルの繰り返し、極端な温度変化は避けてください。

本研究で使用したDNAプライマーは、本論文の末尾に参考文献のリストに引用されている様々な企業から注文することができます。ケアは、汚染を避けるために、DNAのない環境でプライマーを用いて動作するように注意が必要です。プライマーは、少量( 図2a)に分け、乾燥粉末として来るとTEと混合し、100μMの濃度に希釈する必要があります。プライマーのワーキング溶液をさらに10μMの濃度に希釈されています。再び、プライマーが使用され、用意されている地域/フードでDNAサンプルを使用しないでください。

使用しないときは、PCR産物はまた寒さに保つ必要があります。

3%アガロースゲルの調製は、より良いDNAのバンドの分離を与えるが、実行に時間がかかりますでしょう。純粋に定性的な目的のために、2%は通常は十分です。アガロースゲルでDNAを染色するために使用される臭化エチジウム溶液は、皮膚から吸収されている非常にアクティブな遺伝毒性物質である。このソリューションは、それは細心の注意を使用して、常に手袋を着用しているで染色したゲルを取り扱う。任意のDNAサンプルやエチジウムブロマイドの材料を取扱い後はよく手を洗う。エチジウムブロマイド染色液を廃棄する際、制度的なガイドラインに従って洗浄し、ゲル。ゲルは日常的に必須ではありません。FLA方法が確立された後、このステップを排除することができます。それは時間と試薬のかかる作業です。

FLAのための試料の調製に用いホルムアミド溶液はまた、非常に毒性があり、取り扱いには注意してください。その使用後はよく手を洗う。制度的なガイドラインに従って、それを処分する。

ピークスキャナのソフトウェアを使用してFLAの結果を読み込むことは困難な場合があります。アレルコール(タンデムリピートの数)の基本セットは、CSU( 表4-7)で開発されています。 (M.の他の株がらい研究を行っているとして、それは4月7日テーブルはすべての包括的ではないかもしれないことに留意すべきである。、記載されている範囲outsideのコピー数を持つ対立遺伝子が発見されることがあります。)一つの特定の課題は"スタッター'のピークを伴う。これらは、特に唯一、10(TA)として2〜3塩基対の繰り返しを、含むSTRをのピークの家族、です。時には読み取るための正しいピークを選択することは困難である( 図7)。この図では、190 bpの陽性対照のピークが主ピークである。 2である高さの低いピークは、4、あるいは6塩基対は、大規模なまたは主ピークよりも小さい"スタッターピーク"と呼ばれているテーリングも混乱を引き起こす可能性があります。テーリングは、以前のテキストで、 図8に記載されています。最後に、PCR産物は、サンプル中の非常に豊富である場合、ピークはダブルスパイクで表示されることがあります。この場合、ピークフォームの中央を読んで。 ( 図6、患者6を参照してください。)

データ管理は、この種の作業のための手ごわい作業になる場合があります。タスクまたはプロシージャの日付、演算子、ストリップ/プレートのマップ、FLAの受注、PCR条件とレシピ、ゲルや写真の日付、保存温度、DNAテンプレートの希釈、FLA:などのすべての実験のすべての関連情報を記録することが重要です。電子ファイルの保管場所、等グッド組織とデータの管理は、時間の時間を節約することができます将来、特定の情報の断片を探して過ごした。

ここで説明する実験室での作業は、コロラド州立大学で、世界中の他の場所で数年前から続いている。収集されたデータのすべてを意味し、どのように将来の使用の可能性があるものの拡大写真が現れ始めている。 図10Aおよび図10Bは、これらのDNAフィンガープリントが異なるM.を区別するために使用できる方法を示しています家族(10B)との間であっても国(10A)または間にらい菌。家族やコミュニティリンクされているケースはM.を運ぶことが示されているらい類似または同一のVNTRの歪みの種類の。希望は、それは、伝送ネットワークの早期発見のシステムがそれらの人々のMOSのために開発されるように、ハンセン病の伝送のモード(S)さらなる洞察を得ることが可能かもしれないということです永続的な神経学的および皮膚損傷が行われる前に、リスク、およびその治療薬物療法ではtが開始することがあります。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

資金は、NIH / NIAIDの助成金RO1 - AI - 63457およびARRA助成金補助RO1 - AI - 63457 S1によって提供されていました。我々は、実験グループと共同研究者のすべての現在および過去のメンバーの貢献を認める。

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のDNAフィンガープリント<emらい>結核</em可変数のタンデムリピート(VNTR)を使用>菌株 - 断片長解析(FLA)
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Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).More

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

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