נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.
Abstract
במערכת העצבים המרכזית, יונקים, סוגים שונים של נוירונים עם מאפיינים מולקולרית ופונקציונלית מגוונים הם התערבבו זה עם זה, קשה להפריד וגם לא מזוהה בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם. לכן, לעיתים קרובות קשה לנתח ביטוי גנים בסוג נוירון ספציפי. כאן אנחנו המסמך הליך המשלב כל תא מהדק תיקון טכניקות הקלטה עם תא בודד polymerase תגובת שרשרת הפוכה שעתוק (scRT-PCR) ביטוי mRNA פרופיל סוגים שונים של נוירונים nigra משמעותי. טכניקות אלקטרו משמשים הראשון להקליט את המאפיינים neurophysiological ופונקציונלי של נוירונים בודדים. ואז, הציטופלסמה של נוירונים בודדים nigral מאופיין electrophysiologically הוא aspirated ו נתון ניתוח scRT-PCR לקבל ביטוי פרופילים mRNA לסינתזת אנזימים הנוירוטרנסמיטר, קולטנים, ואת תעלות יונים. הסלקטיביות רגישות גבוהה ולעשות שיטה זו שימושית במיוחד כאשר אימונוהיסטוכימיה לא ניתן להשתמש בשל חוסר של נוגדנים מתאימים או רמת ביטוי נמוכה של החלבון. שיטה זו היא גם החלים על הנוירונים באזורים אחרים במוח.
Protocol
1. פרוסת המוח הכנה צעירים (15-40 ימים) זכר ונקבה Sprague-Dawley חולדות משמשות. (בנוסף, אנו משתמשים בפרוטוקול זה זהה אצל עכברים.) תחת הרדמה urethane עמוק, בעלי חיים ערופה לבין המוח הוא גזור במהירות החוצה. אז 300 מיקרומטר בעובי פרוסות המו?…
Discussion
השילוב של הקלטה תיקון מהדק ב פרוסה המוח עם scRT-PCR הראינו כאן לספק שיטה מצוינת לחקור את ביטוי ה-mRNA פרופילים עבור תעלות יונים, קולטנים, ואנזימים מפתח לסינתזה הנוירוטרנסמיטר בנוירונים מאופיין בנפרד. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר החלבון המדובר לא ניתן לאתר מקומי בשיטות אחר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01DA021194 ו R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
Ding, S., Zhou, F. M. Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques. J. Vis. Exp. (55), e3136, doi:10.3791/3136 (2011).