Summary
ニューロンは、最初の電気生理学的に特徴づけられる。その後、記録されたニューロンから細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャンネル、受容体のmRNAの発現を検出するために転写- PCR解析を逆に供される。
Abstract
哺乳類の中枢神経系では、多様な分子と機能的な特性を持つ神経細胞の異なるタイプが、互いに混ざり分離することが困難とも容易にその形態によって識別されていません。従って、それは特定のニューロンタイプに遺伝子発現を解析することは困難です。ここでは、かなりの黒質の神経細胞の異なる種類のプロファイルのmRNA発現の単一細胞逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（SCRT - PCR）で細胞全体のパッチクランプ記録技術を組み合わせた手順を文書化する。電気生理学的手法は、まず個々のニューロンの神経生理学的および機能的特性を記録するために使用されます。次に、単一の電気生理学的特徴と黒質神経細胞の細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、受容体、イオンチャネルのmRNAの発現プロファイルを得るためにSCRT - PCR解析に供される。高選択性と感度は免疫組織化学が原因でsuitable抗体やタンパク質の低い発現レベルの欠如に使用できない場合、このメソッドは特に有用です。また、このメソッドは、他の脳領域の神経細胞に適用可能です。
Protocol
1。脳スライス標本
- ヤングは（15〜40日齢）の雄と雌のSprague - Dawleyラットが使用されます。 （我々はまた、マウスでこれと同じプロトコルを使用する。）深いウレタン麻酔下で、動物を断頭され、脳を速やかに解剖しています。黒質のmidrostral一部を含む、300μmの厚さの冠状脳切片は、ライカビブラトーム（VT - 1200S）にカットされています。手順を切断スライスを含む溶液を（mMで）切る、氷冷、酸素、高ショ糖で実行されます：220ショ糖、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、25のNaHCO 3、0.5 CaCl 2で 、7のMgCl 2、10 D -ブドウ糖。それは、95％酸素化を維持し、pH7.4のpHを維持するためにO 2 / 5％CO 2の混合物にバブリングする。手続きを通じて最先端ソリューションの氷冷をしてください。
- 125のNaCl、2.5 KClを、1.25のNaH 2 PO 4、25のNaHCO 3、2.5のCaCl 2、1.3のMgCl 2、10：脳のスライスを含む酸素人工脳脊髄液（ACSF）（mMで）を充填したインキュベーションチャンバー中でインキュベートされていますD -グルコース。それは、95％酸素化を維持し、pH7.4のpHを維持するためにO 2 / 5％CO 2の混合物にバブリングする。インキュベーション温度は34℃です。室温で45分間、その後のC脳スライスを記録室に転送されるまで。
2。黒質神経細胞の電気生理学的フィンガープリンティング
- 一つの脳のスライスは、連続して32に酸素化されたACSFを灌流パッチクランプ記録チャンバー℃に転送されます。
- パッチピペットはオートクレーブホウケイ酸（KG - 33）PC - 10プーラーを（ナリシゲ、東京、日本）を用いてガラスキャピラリーチューブ（1.10 mm（内径）、1.65 mm外径、キングプレシジョンガラス、クレアモント、カリフォルニア州）から取り出されて細胞内液で満たされているDNアーゼ- RNaseフリー水（フィッシャーサイエンティフィック）（135 mMの塩化カリウム、0.5mMのEGTA、10mMのHEPES、1.5mMのMgCl 2、pH7.3に調整したpHを含む）を用いて調製。パッチピペットは、バスでMΩ2-3の抵抗を持っている。
- 黒質は、その明確な解剖学的位置（ 図1A1 - 2）にしたがって識別されます。黒質緻密部（SNC）および黒質におけるノマルスキー光学系と60Xの水浸レンズを搭載したビデオ顕微鏡（オリンパスBX51W1）、大規模な細胞の視覚的なガイダンスは、網様部の下に（SNR）（可能なDAニューロンとGABAニューロン）が選択されています録音用。従来のギガオームタイトシール全細胞の構成が得られる（ 図1B1）。電流クランプと電圧クランプ解析を行うことができます。 mRNAの分解を最小限に抑えるために、電気生理学的記録は、（≤5分）簡単なはずです。一つのオプションは、興味の神経細胞（ 図B2 - 3）のために電気生理学的指紋を提供する唯一の膜とスパイクの特性を記録することです。この簡潔な記録は、わずか約1分かかります。
3。細胞質の吸引
- SNR GABAおよびDAニューロンの電気生理学的フィンガープリンティングと特性評価の後、穏やかな口の吸引は、細胞質を吸引するために適用されます。細胞核は、ゲノムDNAのコンタミネーションで、その結果、吸引されることがあります。タイトなシールが破られてはいけません、それ以外のmRNAを含む細胞外破片は、パッチピペットに吸引し、セルの内容を汚染する可能性があります。 -70 mVで保持電流の増加が100 pAを超えていないとして、密封の完全性は、長いようなものがあります。
- その後、吸引セルの内容は、ピペットチップや小さな正圧を壊すことによって、0.2mLのPCRチューブに排出されます。一つのセルのコンテンツが複数のPCRチューブに回収される。セルの内容を受け入れた後、収集PCRチューブ、氷上で冷却したが、直ちに-20℃の冷凍庫に配置されます。
- mRNAを含む可能性のある細胞破片の汚染を除外するために、パッチピペットは、実際に細胞質を吸引することなく、組織に低下し、その後ピペットの内容は、RT - PCRに供される。
4。逆転写（RT）
- 通常のニューロンは、10〜20の合理的な数から、セルの内容を収集した後、RTがmRNAの劣化を最小限に抑えるために、直ちに開始する必要があります。
- 単一のニューロンからの細胞のコンテンツの量が小さすぎるので、RNAの単離操作は実行されません。潜在的な汚染ゲノムDNAを除去するには、吸引セルの内容は、最初のDNase I（5μLのDNase Iおよび1.6μLのDNase Iをバッファー、25℃で5分° C）によって消化される。をDNase Iは1.2μLの25 mM EDTAを追加し、5分間75℃でインキュベートすることにより不活化される。
- cDNAをスーパースクリプトIII逆転写酵素ベースのセルダイレクトcDNA合成キット（インビトロジェン、 表1）を用いて合成される。第一鎖cDNAは、50℃で合成される℃で50分間は、その後、反応は85℃インキュベーションによって不活性化される℃で5分間、1μLのRNase Hに対するCの追加です。EDは、mRNA（37℃、20分間）を消化する。一本鎖cDNAは、後のPCR増幅のために-20℃で保存されます。
- ゲノムDNAの完全な除去は、他のすべての反応成分がまったく同じだったしながら逆転写酵素が省略されているRT -マイナスコントロールによって検証されます。
5。二段階PCR増幅
- プライマーは、GenBankの配列に基づいて設計されました。可能な限り、イントロンスパニングプライマーのペアは、ヘルプはゲノムDNAのコンタミを検出するために使用された。プライマー対の配列を表2にリストされています。プライマーペアの有効性は、最初の肯定的な製品を生み出す脳全体のmRNAで検証する必要があります。すべてのプライマーは、統合されたDNA技術（コーラル、アイオワ州、米国）によって合成される。
- 最初の段階では、30μLのcDNAの5μLをプライマー対（ 表2）の存在下で35サイクル増幅されます。サーマルサイクラーのサーマルサイクリングのプロトコール（MasterCycler、エッペンドルフ、 表1）は 、94℃、初期変性のためのC、94℃15秒の後、35サイクル° C変性するために、55℃30秒を° Cでアニールすることで2分です。と72℃で45秒° Cが最後の伸長のための7分間に続いて、拡張する。Taq DNA ポリメラーゼ 、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPの）、およびPCR増幅のために必要な他のすべてのコンポーネントは、PCRスーパーミックス（Invitrogen社製、表1）によって提供される
- 第二段階PCRでは、第1段階 PCR増幅から1μLの製品は、テンプレートとして使用され、最初のステージで使用したものと同じプライマー対は、（ 表2）が使用されます。 40サイクルを30に短縮延長時間で実行されているS.同じPCRスーパーミックスが使用されます。
- 第2段階の増幅からPCR産物を2.5％アガロースゲル電気泳動によって分離され、UV光の下でエチジウムブロマイド（0.05 mg/100 mLのゲル）またはgelgreenによって可視化、および（B4図 ）撮影。切り出した正のバンドはその後、キアゲン抽出キット（ 表1）と配列決定を用いて抽出し、標的遺伝子の公表された配列と比較されます。
6。代表的な結果：
黒質緻密部と網様部と黒質に隣接するGABA投射ニューロンにおけるドーパミン（DA）ニューロンは網様が異なる電気生理学的特性（;丁ら2011。Zhouら2006）がある様部。 図に示す。 1B2、SNR GABAニューロンは、10 Hz付近の高周波自発的なスパイクを示す。スパイクは1ミリ秒程度の基本持続時間を持っている。電流注入を過分極すると、SNR GABAニューロンは、これらのニューロンに電流I H（ 図1B2）の弱い発現を示し、電流注入を過分極に応答して、弱い脱分極サグが表示されます。対照的に、黒質のDAニューロンは（2 Hz付近）ミリ、約3ベースの持続時間を持って自発的なスパイクを低周波数を示す。 DAニューロンはまた、I H電流（ 図1B3）（。。;丁ら2011 Zhouら2006）の強い発現を示し、電流注入を過分極に応答して顕著な電圧低下を示す。
SCRT - PCRは、電気生理学的に同定されたSNR GABAニューロンではなく、DAニューロン（ 図1B4、5）でグルタミン酸脱炭酸酵素1のmRNA（GAD1、GABA合成およびGABAニューロンのマーカーのための重要な酵素）を検出する。対照的に、SCRT - PCRは、電気生理学的に同定されたSNCとSNR DAニューロンではなく、GABAニューロン（ 図1B4、5）でチロシン水酸化酵素のmRNA（ドーパミン合成とDAニューロンのマーカー用TH、鍵酵素）を検出する。そうSCRT - PCRの結果は、電気生理学的ニューロンの同定を確認する。次に、SCRT - PCRは、電圧活性化KV3チャネルサブユニット、Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4の発現をプロファイルするために使用されていました。これらのサブユニットがサブユニットの組成に応じて多様な特性の電位依存性K +チャネル（ディンら、2011）を形成するために貢献する。この例ではSNR GABAニューロンは、 図に示す。 1B4は 、Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAが検出された。 Fig.1B5に示す例ではSNRがDAニューロンでは、唯一のKv3.2、Kv3.3とKv3.4が検出された。私達のプールされたデータでは、Kv3.1はより頻繁に速いスパイクSNR GABAニューロン（ディンら、2011）におけるKv3.1の高い発現レベルを示す、黒質のDAニューロンに比べてSNR GABAニューロンが検出された。
図1。 SNR GABAニューロンと黒質のDAニューロンの電気生理学的同定：黒質領域は、それぞれ異なる解剖学的位置によって識別することができますA1は 1X目的で撮影した冠状ニッスル染色セクションでSNCとSNRの位置を示しています。。箱入りの面積はCAPTURいた矢印で示すように10倍の目標と真ん中に表示されているとED。細胞の豊富なSNCおよびセル悪いSNRがはっきりとわかります。A2は 4X目的で撮影したライブ、未染色の冠状断面におけるSNCとSNRの位置を示しています。細胞の豊富なSNCおよびセル悪いSNRも明確に識別可能です。 VTA、腹側被蓋野。B1には、全細胞モードでクランプされたSNRがGABAニューロンであることパッチを示しています。B2は、現在のクランプ記録モードでのSNR GABAニューロンの典型的な電気生理学的特性を示しています。短い期間のこれらのニューロンの火災自発高周波の活動電位と電流注入を過分極に弱い私は、H -介したサグ応答を持っている。B3は、現在のクランプ記録モードでの黒質のDAニューロンの典型的な電気生理学的特性を示しています。彼らは、長い期間の自発的な低周波の活動電位の発火や著名なI H -介したサグ（矢印の頭）電流注入を過分極に応答している。このように、SNR GABAニューロンと黒質ドーパミンニューロンは明らかに電気生理学的に識別されます。B4電気生理学的同定されたSNRはGABAニューロンからSCRT - PCR産物のゲルの写真を示しています。グルタミン酸脱炭酸酵素1（GAD1）のmRNAがないチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のmRNAが検出されました。 Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAは、このSNR GABAニューロンが検出された。B5は SNR DAニューロンにおける神経KV3チャネルmRNAのSCRT - PCR検出を示しています。 THのmRNAがないGAD1のmRNAは、電気生理学的に同定されたSNR DAニューロンが検出された。 Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAは、このSNR DAニューロンが検出された。B6は、プールされたデータを示しています。
7。潜在的な偽陰性と偽陽性の結果
我々の経験に基づいて、いくつかの要因が偽陰性SCRT - PCRの結果につながることができます。これらの要因は、パッチピペットの先端の目詰まり、RNaseのコンタミ、および非効率的なPCRプライマーによる細胞質の十分な量を吸引で失敗が含まれています。パッチピペットの先端の目詰まりは、通常、ビデオモニタ上で見られるとのアクセスが増加の抵抗によって示すことができます。 RNaseのコンタミは、徹底した非活性化し、手袋することで回避できます。 PCRプライマーの有効性は、脳組織パンチからトータルRNAを使用してテストする必要があります（。Zhouら2008;。ディンら、2011）。
我々は常に、最初のRTの前に我々のサンプルを治療するためにDNaseを使用するので、我々は、偽陽性の結果が発生していない。理論的には、DNase処理なしに、ゲノムDNAのコンタミネーションとそのため偽陽性の検出は、遺伝子がイントロンであるかのプライマー対は、イントロン領域をまたいでいない場合に発生する可能性があります。
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Discussion
SCRT - PCRによる脳スライスにおけるパッチクランプ記録の組み合わせは、我々は、イオンチャネル、受容体、および個々に特徴づけられる神経細胞における神経伝達物質の合成の鍵酵素のmRNA発現プロファイルを調べるための優れた方法を提供するここに示した。これにより、問題がある蛋白質がこのような低発現量に起因する免疫組織化学および/または適切な抗体の欠如など、他の方法を用いて検出し、ローカライズすることができない場合に特に便利です（Surmeierら1996;。Zhouらは2009年。）。 SCRT - PCRの高感度と選択性は、低濃度のmRNA（Surmeierら1996）の検出を可能にする。さらに、この方法により、個々に特徴づけられる神経細胞の電気生理学的および機能的特性（リスら2001; Zhouらは2008年、2009;。ディンら2011。）による遺伝子発現の相関。文献のエビデンスと経験に基づいて、この方法は神経系内のすべてのニューロンタイプに適用可能です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金R01DA021194とR01NS058850によってサポートされていました。
Materials
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Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCRReferences
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
