シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング
Summary
ニューロンは、最初の電気生理学的に特徴づけられる。その後、記録されたニューロンから細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャンネル、受容体のmRNAの発現を検出するために転写- PCR解析を逆に供される。
Abstract
哺乳類の中枢神経系では、多様な分子と機能的な特性を持つ神経細胞の異なるタイプが、互いに混ざり分離することが困難とも容易にその形態によって識別されていません。従って、それは特定のニューロンタイプに遺伝子発現を解析することは困難です。ここでは、かなりの黒質の神経細胞の異なる種類のプロファイルのmRNA発現の単一細胞逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（SCRT – PCR）で細胞全体のパッチクランプ記録技術を組み合わせた手順を文書化する。電気生理学的手法は、まず個々のニューロンの神経生理学的および機能的特性を記録するために使用されます。次に、単一の電気生理学的特徴と黒質神経細胞の細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、受容体、イオンチャネルのmRNAの発現プロファイルを得るためにSCRT – PCR解析に供される。高選択性と感度は免疫組織化学が原因でsuitable抗体やタンパク質の低い発現レベルの欠如に使用できない場合、このメソッドは特に有用です。また、このメソッドは、他の脳領域の神経細胞に適用可能です。
Protocol
Discussion
SCRT – PCRによる脳スライスにおけるパッチクランプ記録の組み合わせは、我々は、イオンチャネル、受容体、および個々に特徴づけられる神経細胞における神経伝達物質の合成の鍵酵素のmRNA発現プロファイルを調べるための優れた方法を提供するここに示した。これにより、問題がある蛋白質がこのような低発現量に起因する免疫組織化学および/または適切な抗体の欠如など、他の方法…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金R01DA021194とR01NS058850によってサポートされていました。
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
References
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
