Исследование печени синусоидальных эндотелиальных клеток (СПК) должны быть выполнены с первичными клеток, полученных от животных, как не клеточные линии существуют. Этот метод основан на пищеварение печени и дифференциального центрифугирования в течение SEC очистки для последующего выращивания и экспериментов.
The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (˜100 μm) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.
Анестезия крыс по висячей капли метод, в котором изофлуран паров вызывает бессознательное является предпочтительным методом для наших исследований. Испаритель может также быть использован вместо шприца с хлопком для поддержания животных вне камеры, но хирургические процедуры настолько быстро, это не требуется. Полиэтиленгликоль добавляется в изофлуран для уменьшения давления пара и скорости испарения. Слишком много изофлуран пара будет вызывать смерть слишком быстро. Если животное умирает, прежде чем печень канюлированные и бланшированные с TBS, объединение сгусток крови может в печени и не допустить эффективной промывки синусоиды и пищеварения с коллагеназы. Кроме того гепарина может быть полезна в качестве антикоагулянта, но не используется в этих исследованиях, так как мы используем меченый гепарин в качестве нашего зонда.
Буферном растворе решение Гей (в GBSS) часто заменяются другими лабораториями для очистки СПК. Хотя это полезно для SEC очистки, ГПУatocytes не терпят GBSS а также буферы 1-3 и viabilities далеко не так высока. При измерении эндоцитоз, это хорошая практика для измерения фоновых уровней в органе и в очищенной гепатоцитов.
Этот метод является одним из двух для эффективной очистки СПК следующие печени перфузии с коллагеназы. Другой метод отделяет без паренхиматозных клеток отмучивания центрифугирования 19 вместо Перколла градиента. Преимущества использования отмучивания более градиенты Перколла несколько выше, клетка viabilities и цифры. Недостатком является то, что отмучивания центрифугирования требует специализированных ротора, посвященный центрифугу, и перистальтического насоса вместе, которая стоит десятки тысяч долларов. Этот метод требует только использование охлажденного центрифуги столешницы и перистальтического насоса, который является стандартным во многих лабораториях.
Разделение СПК и KCS селективной адгезии является стандартным методом20-22. Хотя это правда, что СПК будет придерживаться стекла и пластика, ключевой момент заключается в использовании кислотно-отмытый стекло с не более чем на 15 минут инкубации при температуре 37 ° С на 5% CO 2. KCS всегда будет придерживаться быстрее, чем СПК, и желательно, чтобы аккуратно мыть крон со средствами массовой информации для извлечения оставшихся СПК, которые стали свободно прилагается. Проназы и других протеаз, также исключены из коллагеназы пищеварения шаги в этом протоколе увеличить viabilities клеток. Протеазы переварить внеклеточной рецепторов и может препятствовать клеточной адгезии в окончательной стадии очистки.
Метод, представленный здесь, имеет широкий спектр применения. Хотя мы и показать конечный результат, в которой гепарин изначально принято к оформлению, перфузии печени для получения первичных гепатоцитах, KC, СПК, и гемопоэтические стволовые клетки могут быть полезны для ряда исследований с участием метаболических путей, иммунорегуляции, мусорщик деятельности, а также других физиологические Studiх годов. Самой трудной частью этой процедуры является хорошим катетеризации, пищеварение печени, и обработка печени без катетера скольжения от воротной вены.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Пола Вайгель в Univ. Оклахома для использования моноклональных антител 30 для обнаружения HARE/Stabilin-2 рецепторов и Джанет Вайгель за техническую помощь. Это исследование финансируется за счет средств университета Небраски исследований.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |